分子生物学.ppt

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1、分子生物学课件现在学习的是第1页，共51页现在学习的是第2页，共51页PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理 现在学习的是第3页，共51页模板DNA95PCR循环过程现在学习的是第4页，共51页50引物1引物2DNA引物PCR循环过程现在学习的是第5页，共51页引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR循环过程现在学习的是第6页，共51页第1轮结束95第2轮开始PCR循环过程现在学习的是第7页，共51页72TaqTaqTaqTaqPCR循环过程5095现在学习的是第8页，共51页72第2轮结束PCR循环过程现在学习的是第9页，共51页模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第

2、5轮扩增PCR循环过程第6轮扩增现在学习的是第10页，共51页PCRPCR的反应动力学的反应动力学 PCRPCR的三个反应步骤反复进行，使的三个反应步骤反复进行，使DNADNA扩增量呈指扩增量呈指数上升。平均扩增效率的理论值为数上升。平均扩增效率的理论值为100%100%，但在实际反，但在实际反应中平均效率达不到理论值。应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列反应初期，靶序列DNADNA片段的增加呈指数形式，随着片段的增加呈指数形式，随着PCRPCR产物的逐渐积累，产物的逐渐积累，被扩被扩增的增的DNADNA片段片段不再呈指数增加不再呈指数增加，而进入线性增长期或静，而进入线性增长期或静止期

3、，即出现止期，即出现“停滞效应停滞效应”，这种效应期称这种效应期称平台期平台期。大多大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。数情况下，平台期的到来是不可避免的。现在学习的是第11页，共51页 PCR扩增体系扩增体系模板模板 3TTAGGCCTGGATAAGCGCCTGGA 5引物引物 5TCCGG C TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶底物底物现在学习的是第12页，共51页 PCR PCR 反应体系反应体系PCRPCR反应五要素：反应五要素：引物、酶、引物、酶、dNTPdNTP、模板和、模板和Mg2+Mg2+ 标准的标准的PCRPCR反应体系：反应体系：1010扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul

4、10ul4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ug Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5uMg2+Mg2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul100ul现在学习的是第13页，共51页引物引物 引物是人工合成的引物是人工合成的两段寡核苷酸单链，两段寡核苷酸单链，是是PCRPCR特特异性反应异性反应的关键，扩增产物的大小也由特异引物限定的关键，扩增产物的大小也由特异引物限定。3 3 现在学习的是第14页

5、，共51页设计引物应遵循以下原则：设计引物应遵循以下原则：引物引物长度长度： 15-30bp15-30bp，常用为，常用为20-27bp20-27bp左右。在做长片段左右。在做长片段PCRPCR或做某或做某些特殊的些特殊的PCRPCR时应使用较长的引物，但最多不超过时应使用较长的引物，但最多不超过5050个核苷个核苷酸酸引物引物碱基碱基： G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%为宜，过高或过低均不利于引发。为宜，过高或过低均不利于引发。ATGCATGC最好随机分布最好随机分布，避免聚嘌呤或嘧啶核苷酸。，避免聚嘌呤或嘧啶核苷酸。避免引物自身互补避免引物自身互补，形成发夹结构，因空间位阻

6、而影响其，形成发夹结构，因空间位阻而影响其与模板结合。与模板结合。两条引物间之间也不能互补两条引物间之间也不能互补，否则会形成，否则会形成引物引物二聚体二聚体，产生非特异的扩增条带或降低引物有效浓度。，产生非特异的扩增条带或降低引物有效浓度。现在学习的是第15页，共51页引物引物33端的碱基端的碱基，应严格要求配对，应严格要求配对，不可修饰，不可修饰，以避免，以避免因末端碱基不配对而导致因末端碱基不配对而导致PCRPCR失败。考虑到失败。考虑到密码子的简并性密码子的简并性，引物，引物33端不终止于密码子第三个碱基端不终止于密码子第三个碱基。因该位置由于密。因该位置由于密码子的简并性影响扩增的特

7、异性。码子的简并性影响扩增的特异性。 引物的引物的5 5端可以修饰端可以修饰，它对扩增特异性影响不大。，它对扩增特异性影响不大。如如增加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入点突变、增加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入点突变、启动子序列等。启动子序列等。引物的引物的特异性特异性： 引物应该与引物应该与核酸序列数据库的核酸序列数据库的其它序列无明显的同源其它序列无明显的同源性，性，以减少引物与基因组的非特异性结合。以减少引物与基因组的非特异性结合。现在学习的是第16页，共51页简并引物简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列

8、反推反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列多种序列的引物的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的。这样的混合引物混合引物称简并引物称简并引物。 简并性简并性(degeneracy)(degeneracy) 遗传密码中，除色氨酸和蛋氨酸仅有一个密码子外，遗传密码中，除色氨酸和蛋氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸均有多个密码子。其余氨基酸均有多个密码子。现在学习的是第17页，共51页例如，例如， 序列序列1 1：tg tg a a atgcatgcatgc atgcatgcatgc 序列序列2 2：tg tg c

9、c atgcatgcatgc atgcatgcatgc 序列序列3 3：tg tg t t atgcatgcatgcatgcatgcatgc 若样品并不能明确是若样品并不能明确是1 1，2 2还是还是3 3，为了能从不确定序列，为了能从不确定序列来源的样本中，扩增出同源序列来，你的引物实际上就是来源的样本中，扩增出同源序列来，你的引物实际上就是针针对序列对序列1 1，2 2，3 3设计的混合物设计的混合物。这样不论是。这样不论是1 1，2 2还是还是3 3，采，采用你的引物均能有效扩增。用你的引物均能有效扩增。 现在学习的是第18页，共51页套嵌引物套嵌引物 设计多组引物，结合位点依次位于前一

10、组引物之间。设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。增加扩增产物的特异性。1324现在学习的是第19页，共51页 引物的溶解与保存：引物的溶解与保存： 引物量：引物量： 现在学习的是第20页，共51页DNADNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶聚合酶 热稳定性热稳定性最大特点是最大特点是热稳定性热稳定性，耐高温，非常适合，耐高温，非常适合PCRPCR过程的反复过程的反复高温变性要求。高温变性要求。 最适温度高最适温度高最适温度：最适温度： 74-80 74-80 o oC (PCRC (PCR延伸：延伸：7272-）延伸速度：延伸速度： 约约35-150nt/s.

11、35-150nt/s.酶分子酶分子 最长延伸长度：最长延伸长度： 6.7kb6.7kb现在学习的是第21页，共51页 Taq酶的功能缺点酶的功能缺点具有具有5 53 3聚合酶活性和聚合酶活性和5 53 3外切酶活性，但没有外切酶活性，但没有3 35 5外切酶活性。外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！因此不能修复错误的碱基配对！ 合成超过合成超过600bp长度的长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。基因时必须测序。 金属离子敏感（尤其是金属离子敏感（尤其是MgMg2+ 2+ ）。）。 现在学习的是第22页，共51页 1. 1. 不同的公司或不同批次

12、的产品常有不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异很大的差异，由于酶的浓度对，由于酶的浓度对PCRPCR反应影响极大，因此应当作反应影响极大，因此应当作预预试验或使用厂家推荐的浓度试验或使用厂家推荐的浓度。 2. 2. 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少物量减少. .现在学习的是第23页，共51页底物：底物：dNTPdNTP1. dNTP1. dNTP小量分装，小量分装，-20-20冰冻保存。冰冻保存。多次冻融会使多次冻融会使dNTPdNTP降降解。解。在在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为5050200umol/

13、L200umol/L，不能低于，不能低于101015mol/L15mol/L。浓度过高浓度过高，与与MgMg2+2+结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度降低，抑制浓度降低，抑制Taq DNATaq DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。浓度过低浓度过低又会又会降低降低PCRPCR产物的产量。产物的产量。2. 2. 尤其是注意尤其是注意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等的浓度要相等( ( 等摩尔配制等摩尔配制) )，如，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。降其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。降低合成速度，过早终止反应。低合成速度，过早终止反应。 现在学习的

14、是第24页，共51页模板模板( (靶基因靶基因) )要求：要求：1. 1001. 100 l l反应体系中质粒反应体系中质粒DNA 1-10ngDNA 1-10ng，基因组，基因组DNA 50-DNA 50-100ng 100ng 足够。足够。2. 2. 纯度要求不太严格，可以是粗品，纯度要求不太严格，可以是粗品，但不能混有但不能混有SDSSDS、有、有机溶剂酚、氯仿等机溶剂酚、氯仿等蛋白质变性剂蛋白质变性剂以及任何以及任何蛋白酶、核酸酶蛋白酶、核酸酶、Taq DNATaq DNA聚合酶抑制剂以及能结合聚合酶抑制剂以及能结合DNADNA的蛋白。的蛋白。 现在学习的是第25页，共51页模板的种类

15、：模板的种类：DNADNA或或RNARNA。1. RNA1. RNA：先通过：先通过反转录得到反转录得到cDNAcDNA。2. 2. 质粒：线性化的比环状的效果好，但在实际操作质粒：线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板直接用做模板。3. 3. 高分子量高分子量的脱氧核糖核酸（如基因组脱氧核糖核的脱氧核糖核酸（如基因组脱氧核糖核酸）做模板时，如果用酸）做模板时，如果用适当的酶先进行消化适当的酶先进行消化再作为模再作为模板，扩增效果会更好。板，扩增效果会更好。现在学习的是第26页，共51页Mg2+ Mg2+Mg2+对对PCRP

16、CR扩增的特异性和产量有显著的影响扩增的特异性和产量有显著的影响。 Mg2+ Mg2+可以可以与与dNTPdNTP结合结合，易化，易化4 4种种dNTPdNTP的协作，而的协作，而且可以促进和稳定引物且可以促进和稳定引物- -模板的相互作用。因此，模板的相互作用。因此，Mg2+Mg2+浓度浓度过高，可出现非特异扩增过高，可出现非特异扩增。 浓度过低会降低浓度过低会降低Taq DNATaq DNA聚合酶的活性聚合酶的活性，使反应，使反应产物减少。在一般的产物减少。在一般的PCRPCR反应中，反应中，各种各种dNTPdNTP浓度为浓度为200200 mol/Lmol/L时，时，Mg2+Mg2+终浓

17、度为终浓度为1.51.52.0mmol/L2.0mmol/L为宜。为宜。 现在学习的是第27页，共51页PCRPCR反应条件的选择反应条件的选择 基于基于PCRPCR原理三步骤而设置原理三步骤而设置变性变性- -退火退火- -延伸延伸三个温度三个温度点。标准反应中采用三温度点法点。标准反应中采用三温度点法 对于对于较短靶基因较短靶基因( (长度为长度为100100300bp300bp时时) )可采用二温度点可采用二温度点法，除法，除变性温度变性温度外、外、退火与延伸温度可合二为一退火与延伸温度可合二为一，一，一般采用般采用9494变性，变性，6565左右退火与延伸左右退火与延伸( (此温度此温

18、度Taq Taq DNADNA酶仍有较高的催化活性酶仍有较高的催化活性) )。 - 温度与时间的设置温度与时间的设置现在学习的是第28页，共51页变性温度与时间变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全变性温度低，解链不完全是导致是导致PCRPCR失败的最主失败的最主要原因。要原因。 一般情况下，一般情况下，939394 1min94 1min足以使模板足以使模板DNADNA变性，若低于变性，若低于9393则需延长时间，则需延长时间，但温度不能过高，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响因为高温环境对酶的活性有影响。现在学习的是第29页，共51页退火温度与时间：退火温度与时间： 退火温度与

19、时间，取决于退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度浓度，还有靶基因序列的长度。 TmTm值值( (解链温度解链温度)=)=4(G+C)4(G+C)2(A+T)2(A+T)退火温度退火温度=Tm=Tm值值- (5- (510)10)在在TmTm值允许范围内值允许范围内，选择，选择较高的退火温度较高的退火温度可大大可大大减少减少引物和模板间的引物和模板间的非特异性非特异性结合。结合。 退火时间一般为退火时间一般为303060sec60sec，足以使引物与模板之间完全，足以使引物与模板之间完全结合。结合。 现在学习的是第30页，共51页延伸温

20、度与时间延伸温度与时间 Taq DNA Taq DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性： 707080 150 80 150 核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 70 60 70 60 核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 55 24 55 24 核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 高于高于9090时，时， DNADNA合成几乎不能进行合成几乎不能进行延伸温度一般选择在延伸温度一般选择在70707575之间，之间，常用温度为常用温度为7272。 反应时间，可据扩增片段的长度而定：反应时间，可据扩增片段的长度而定： 一般一般1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1m

21、in1min足够。足够。 3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min； 10Kb 10Kb需延伸至需延伸至15min15min现在学习的是第31页，共51页 循环次数循环次数 循环次数影响循环次数影响PCRPCR扩增程度。扩增程度。PCRPCR循环次数主要取循环次数主要取决于决于模板模板DNADNA的的浓度浓度。一般为。一般为25-3025-30次，次，3535次左右时，达次左右时，达到平台期到平台期。循环。循环次数越多次数越多，非特异性产物的量亦随之增多非特异性产物的量亦随之增多。 现在学习的是第32页，共51页 PCR扩增产物分析扩增产物分析 1.1.凝胶电泳分析凝胶电泳

22、分析：PCRPCR产物电泳，产物电泳，EBEB染色染色, ,紫外仪下观察紫外仪下观察.PCR.PCR产物片段的大小应与预计的一致。产物片段的大小应与预计的一致。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：通常应用：通常应用1 12%2%的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶，供检测用。，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：6 610%10%聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，分辨率高，分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，而且分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，而且DNADNA回收纯度高。回收纯度高。现在学习的是第33页，共51页2. 2. 酶切分析酶切分析：根据：根据PCRPCR产物中限制性内切酶的位点

23、，用相应产物中限制性内切酶的位点，用相应的的酶切、电泳分离后酶切、电泳分离后，获得，获得符合理论的片段，符合理论的片段，此法既能进行此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。3. 3. 分子杂交分子杂交：如：如SouthernSouthern印迹杂交：在两引物之间另合成一印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链，标记后做探针，与条寡核苷酸链，标记后做探针，与PCRPCR产物杂交。此法既产物杂交。此法既可作特异性鉴定，还可知其分子量。可作特异性鉴定，还可知其分子量。4. 4. 斑点杂交斑点杂交：将：将PCRPCR产物点在硝酸

24、纤维素膜或尼龙膜产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上，薄膜上，再用放射性或非放射性寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点再用放射性或非放射性寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于，主要用于PCRPCR产物特异性鉴定及变异分析。产物特异性鉴定及变异分析。5.5.核酸序列分析：核酸序列分析：是是检测检测PCRPCR产物特异性的最可靠产物特异性的最可靠方法。方法。 现在学习的是第34页，共51页阳性对照阳性对照: : 是是PCRPCR反应是否成反应是否成功、产物条带位置及大小是功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要否合乎理论要求的一个重要的参考标志。的参考标志。现在学习的是第35页，共51

25、页PCR反应的关键环节有反应的关键环节有: 模板的制备，模板的制备， 引物的质量与特异性，引物的质量与特异性， 酶的质量及活性酶的质量及活性 PCR循环条件循环条件 PCR产物的电泳检测时间一般为产物的电泳检测时间一般为48h以内，以内，有些最好于当日电泳检测，大于有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规后带型不规则甚致消失则甚致消失 注意注意现在学习的是第36页，共51页1、PCR常见问题：常见问题： 出现非特异性扩增带出现非特异性扩增带 无特异性扩增带无特异性扩增带2、出现非特异性扩增带可能原因、出现非特异性扩增带可能原因 酶量过多酶量过多Mg2+浓度过高浓度过高dNTP浓度过高浓度过

26、高 引物浓度过高，引物设计特异性差引物浓度过高，引物设计特异性差模板纯度差模板纯度差 退火温度过低退火温度过低 循环次数过多循环次数过多现在学习的是第37页，共51页现在学习的是第38页，共51页片状拖带或涂抹带片状拖带或涂抹带 其原因往往由于酶量过多或酶的质量其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，差，dNTPdNTP浓度过高，浓度过高，Mg2+Mg2+浓度过高，退浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。火温度过低，循环次数过多引起。 对策：对策： 减少酶量，或调换另一来源的酶。减少酶量，或调换另一来源的酶。 减少减少dNTPdNTP的浓度。的浓度。 适当降低适当降低Mg2+Mg2+浓度。浓度

27、。 减少循环次数。减少循环次数。 现在学习的是第39页，共51页假阴性假阴性 模板：模板：模板中含有模板中含有TaqTaq酶抑制剂酶抑制剂. . 提取制备模板提取制备模板时时丢失丢失过多，或过多，或吸入酚吸入酚. . 模板模板变性不彻变性不彻底底. .对策：对策：配制有效而稳定的消化处理液配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随其程序亦应固定不宜随意更改意更改 酶失活酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因析是否因酶的活性丧失或不够酶的活性丧失或不够而导致假阴性。（而导致假阴性。（有时有时忘加忘加TaqTaq酶）酶）. .现在学习的

28、是第40页，共51页3. 3. 引物引物：引物的设计、质量、浓度、两条引物的浓度：引物的设计、质量、浓度、两条引物的浓度是否对称，是是否对称，是PCRPCR失败或扩增条带不理想、容易弥散失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。的常见原因。 对策为：对策为： 选定好的引物合成单位。选定好的引物合成单位。 引物的浓度不仅要看引物的浓度不仅要看ODOD值，值，更要注重引物原液做琼更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致。如一条引物有条带，一物带的亮度应大体一致。如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做条引物无条

29、带，此时做PCRPCR有可能失败，应和引物有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。低，在稀释引物时要平衡其浓度。 引物应引物应高浓度小量分装保存高浓度小量分装保存, ,防止多次冻融或长期防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分放冰箱冷藏部分, ,导致引物降解失效。导致引物降解失效。现在学习的是第41页，共51页假阴性假阴性4.Mg2+4.Mg2+浓度浓度：浓度：浓度过高可降低过高可降低PCRPCR扩增的扩增的特异性特异性，浓度，浓度过过低则影响低则影响PCRPCR扩增产量，扩增产量，甚至使甚至使PCRPC

30、R扩增失败而不出扩增扩增失败而不出扩增条带。条带。5.5.反应体积的改变反应体积的改变：在做小体积如在做小体积如20ul20ul后，再做大体积时后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。，一定要模索条件，否则容易失败。6.6.物理原因物理原因：如变性温度低，变性时间短，极有可能出：如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性现假阴性; ;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率性扩增效率. .退火温度过高影响引物与模板的结合而降退火温度过高影响引物与模板的结合而降低低PCRPCR扩增效率。扩增效率。7.7.靶序列变异：靶序列变异：如靶序列

31、发生突变或缺失，影响引物与模板如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其序列，其PCRPCR扩增是不会成功的。扩增是不会成功的。 现在学习的是第42页，共51页假阳性假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物。现象：空白对照出现目的扩增产物。 出现的出现的PCRPCR扩增条带与目的靶序列条带一致扩增条带与目的靶序列条带一致，但其条带更整齐，亮度更高，但其条带更整齐，亮度更高引物设计不合适：引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增选择的扩增序列与非目的扩增序列有序列有同源性同源性，因而可能扩增出

32、的，因而可能扩增出的PCRPCR产物为非目产物为非目的性的序列。的性的序列。引物太短，引物太短，容易出现假阳性。容易出现假阳性。靶序列或扩增产物的交叉污染：靶序列或扩增产物的交叉污染：一是一是整个整个基因组基因组或大片段的交叉污染或大片段的交叉污染，导致假阳性。，导致假阳性。二是空气中二是空气中的小片段核酸污染，的小片段核酸污染，可用可用巢式巢式PCRPCR方法来减轻或消方法来减轻或消除。除。现在学习的是第43页，共51页PCR污染的对策污染的对策 PCR前试剂前试剂准备区准备区 PCR前样前样本处理区本处理区加样区加样区PCR扩增扩增检测区检测区(一一)合理分隔实验室合理分隔实验室: 将样品

33、的处理、配制将样品的处理、配制PCRPCR反应液、反应液、PCRPCR循环扩增及循环扩增及PCRPCR产物的鉴定等步骤产物的鉴定等步骤分区分区或分室或分室进行，特别注意样进行，特别注意样本处理及本处理及PCRPCR产物的鉴定应产物的鉴定应与其它步骤严格分开。与其它步骤严格分开。 实验用品及吸样枪应实验用品及吸样枪应专用专用，实验前应将实验室，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留用紫外线消毒以破坏残留的脱氧核糖核酸或的脱氧核糖核酸或RNARNA。现在学习的是第44页，共51页 现在学习的是第45页，共51页Reverse transcription-polymerase chain reaction 反转录反转录PCRRT-PCR现在学习的是第46页，共51页现在学习的是第47页，共51页反转录体系反转录体系RNARNA模板模板 3UUAGGCCUGGAUAAGCGCCUGGA 5 5TCCC 反转录酶反转录酶 酶活性依赖金属离子酶活性依赖金属离子底物底物现在学习的是第48页，共51页现在学习的是第49页，共51页现在学习的是第50页，共51页现在学习的是第51页，共51页