动物免疫学实验指导(24页).doc

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1、-动物免疫学实验指导-第 22 页动物免疫学实验指导第二版徐春厚 谢为天 雍艳红 编动物医学 生物技术专业用广东海洋大学教材科出版二00七年二月二十八日目 录实验一 凝集试验1实验二 沉淀试验4实验三 溶血试验8实验四 病毒的血凝及血凝抑制试验 10实验五 E-玫瑰花环试验 13实验六 EA玫瑰花环试验 15实验七 EAC玫瑰花环试验17实验八 酶联免疫吸附试验 18实验九 荧光抗体技术 20实验十 多克隆抗体（免疫血清）的制备 22实验一 凝集试验颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutina

2、tion reaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。凝集反应包括直接凝集反应和间接

3、凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。目的要求1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。材料与试剂1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。实

4、验内容及操作方法（一）试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检血清有多份，对照只需做1份。2. 被检血清稀释： ml 0.5% 石炭酸生理盐水， ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用 ml ，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取 ml 弃之，再吸取 ml 加入第2管中，混匀后 ml ml （见表1-1）。该被检血清的稀释度分别是1:12.5、1:25、1:50、1:100。3. 对照管制作：第5管中加0.5% ml ml ml 。4. 加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5% 石炭酸生理盐水作 ml

5、。 表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml）试 管 号1234567对 照 管最终血清稀释度1：251：501：1001：200抗 原阳性血清阴性血清1：251：250.5%石炭酸生理盐水被检血清抗原(1：20)5. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37温箱中22-24 h取出），然后观察并记录结果。6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。：100抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被

6、凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。：75抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。：50抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。：25抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的

7、凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应（可疑）。注意事项1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。2. 结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。（二）布氏杆菌病平板凝集试验1. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm2），并注明被检血清号码，以100mL微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l格80mL、第2格4

8、0mL、第3格20mL、第4格10mL。血清用前需放室温，使其温度达20左右。每一份检样需换一个tip头。大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40mL 和20mL ；猪、山羊、绵羊、狗用80mL和40mL。2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30mL，滴在血清附近，而不与血清接触。从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20左右。3. 作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30左右，3-5min内记录反应结果。4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。5. 结

9、果判定：按下列标准记录反应结果。：出现大的凝集块，液体完全透明，即100% 凝集。：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75% 凝集。：有可见凝集块，液体不甚透明，即50% 凝集。：液体混浊，有小的颗粒状物，即25% 凝集。：液体均匀混浊，无凝集现象。6. 平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表1-2。表1-2 平板凝集试验与试管凝集试验的关系平 板 凝 集80mL40mL20mL10mL相当于试管凝集1:251:501:1001:2007. 判定标准：同试管凝集试验。8. 注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。（三）虎红平板凝集试验这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎

10、红制成。虎红平板凝集试验可与试管凝集试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。1. 被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30mL滴于玻璃板的方格内，每份血清各用一支牙签或火柴棒混合均匀。在室温（20）4-10min内记录反应结果。同时以阳、阴性血清作对照。 2. 结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。3. 注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。（四）鸡白痢平板凝集试验1. 被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30mL）滴于玻板或载玻片上

11、，用牙签或火柴棒充分混合。2. 结果判定：在室温（20）下，观察30-60s，凝集者为阳性，不凝集者为阴性。思考题1. 凝集反应的原理是什么?2. 哪些因素影响细菌凝集试验?3. 凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？实验二 沉淀试验可溶性抗原(如细菌浸出液、含菌病料浸出液、病毒、血清以及其他来源的蛋白质、多糖、类脂等)与其相应的抗体结合后，在电解质参与下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀反应(Precipitation reaction)。 沉淀反应中的抗原称为沉淀原（Precipitinogen），抗体称为沉淀素（Precipitin）。沉淀反应主要包括有环状沉淀试验、琼脂扩散沉淀

12、试验及免疫电泳等。目的要求1. 掌握炭疽环状沉淀试验的操作方法和结果观察。2. 掌握琼脂扩散沉淀试验的原理和操作方法。3. 了解对流免疫电泳的般原理和操作技术。材料与试剂1. 口径的小试管，毛细滴管，载玻片，平皿，烧杯没，打孔器，针头，酒精灯，加样器（移液器），滴头，电泳槽，电泳仪等。2. 生理盐水，8.5% NaCl溶液，0.5% 石炭酸生理盐水，巴比妥缓冲液，琼脂粉等。3. 炭疽沉淀抗原（炭疽标准抗原），炭疽沉淀素血清，待检抗原。4. 禽流感琼扩抗原，禽流感阳性血清，待检鸡血清；兔抗猪IgG，猪血清，鸡血清，兔血清、牛血清，羊血清等。5. 小鹅瘟琼扩抗原，小鹅瘟抗血清；鸡传染性法氏囊病琼扩

13、抗原（或待检法氏囊组织浸提液），鸡传染性法氏囊病阳性血清。实验内容及操作方法 （一）环状沉淀试验环状沉淀试验(Ring precipitation test)是最早的沉淀反应。目前在链球菌的分类、鉴定，昆虫吸血性能及所吸血液来自何种动物的鉴别，肉品种属鉴定及炭疽尸体与皮张的检验工作中仍然应用。以炭疽环状沉淀反应为例，此反应又称Ascoli氏反应。1. 待检抗原的制备(1) 取疑为炭疽死亡动物的实质脏器1g放入小烧杯中剪碎，加生理盐水5-10ml，煮沸30min，冷却后用滤纸过滤使之呈清澈透明的液体，即为待检抗原。(2) 如待检材料是皮张、兽毛等，可采用冷浸法。先将样品高压灭菌30min后，皮张

14、剪为小块并称重，加5-10倍的0.5% 石炭酸生理盐水，置室温浸泡10-24h。用滤纸过滤2-3次，使之呈清朗的液体，此即为待检抗原。2. 加样：取3支口径 ml 的炭疽沉淀素血清(用毛细滴管加，注意液面勿有气泡)。取其1支，用毛细滴管将待检抗原沿着管壁轻轻加入使重叠在炭疽沉淀素血清之上，上下两液间有一整齐的界面，注意勿产生气泡。另2支小试管，一支加炭疽沉淀抗原，另一支加生理盐水，方法同上，作为对照。3. 结果判定：5-10min内判定结果，上下重叠两液界面上出现乳白色环者，为炭疽阳性。对照组中，加炭疽沉淀抗原者应出现白环，而加生理盐水者应不出现白环。4. 注意：观察结果时，可将一只手放在小试

15、管对测的适当位置上遮挡光线，有利于看到白色沉淀环。（二）琼脂扩散沉淀试验琼脂扩散沉淀试验（Agar gel precipitation test，AGPT）是沉淀反应的一种形式。物质自由运动形成扩散现象，扩散可以在各种介质中进行。1% 琼脂凝胶形成网状构架，空隙中是98%-99% 的水，允许分子量在200ku以下分子通过。绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在200ku以下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处结合成复合物，此复合物因颗粒较大而不能扩散，故形成沉淀带。本试验可用已知抗体检测样品中的抗原，也可用已知抗原检测血清样品中的抗体。1. 琼脂板制备：

16、称取1g琼脂粉，加入100ml 生理盐水或8.5% NaCl溶液（禽类），煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60左右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。2. 打孔：用打孔器在琼脂凝胶板上按7孔梅花图案打孔，孔径约3-5mm，中心孔和周围孔间的距离约为3-5mm。挑出孔内琼脂凝胶，注意不要挑破孔的边缘。3. 封底：在火焰上缓缓加热，使孔底琼脂凝胶微微融化，以防止孔底边缘渗漏。4. 加样：以毛细滴管（或加样器）将样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。（1）血清流行病学调查：将禽流感琼扩抗原置中心孔，周围1、3、5孔加禽流感阳性血清，2、4、6孔分别加待检鸡血清，每加一个样品应换一个滴头。（2）抗

17、血清效价测定：将猪血清（抗原）加入中心孔，将兔抗猪IgG（抗体）作2倍比稀释，即 l:2、1:4、1:8、l:16、1:32等，分别加至周围孔中。或者是将小鹅瘟琼扩抗原加入中心孔，周围孔加入l:2、1:4、1:8、l:16、1:32等稀释的小鹅瘟抗血清。（3）抗原检测：将兔抗猪IgG（抗血清）加入中心孔，将待测抗原（猪血清、鸡血清、兔血清、牛血清、羊血清等）置于周围孔中。或者是将鸡传染性法氏囊病阳性血清加入中心孔，周围孔加鸡传染性法氏囊病琼扩抗原（或待检法氏囊组织浸提液）。 5. 感作：将琼脂凝胶板加盖保湿，置于37温箱，24-48h后，判定结果。6. 结果判定（1）血清流行病学调查：待检孔与

18、阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性。待检血清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带完全交叉者判为阴性。（2）抗血清效价测定：以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为抗血清的AGP效价。（3）抗原检测：兔抗猪IgG与猪血清孔之间有明显沉淀带，与其他血清孔之间不形成沉淀带。鸡传染性法氏囊病阳性血清与鸡传染性法氏囊病琼扩抗原孔之间出现沉淀带，如与待组织浸提液孔之间出现沉淀带，说明该法氏囊组织中有鸡传染性法氏囊病病毒抗原。（三）对流免疫电泳在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白带有微弱的负电荷，在电泳时，由于电渗作用的影响，抗体球蛋白反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质带负电荷，在电泳力的作用下向正极移动。

19、二者在两孔之间相遇，形成肉眼可见的白色沉淀线。本法由于抗原抗体分子在电场作用下定向运动，限制了自由扩散，从而提高了敏感性，它较琼脂扩散试验敏感性高10-16倍，并可大大缩短沉淀线出现的时间，适用于快速诊断。1. 琼脂板制备：用巴比妥缓冲液配制1%-1.5% 琼脂凝胶板，厚度2-3mm。2. 打孔：孔径3-5mm，孔距4-10mm，一张载玻片可打12个孔，挑去孔内琼脂，封底。3. 加样：一对孔中，一孔加已知（或待测）抗原，另一孔加待测（或已知）抗体。/cm，或电流强度3-5mA/cm，电泳时间为30-90min 。5. 结果观察：断电后，将凝胶板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原与抗体

20、孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可将琼脂凝胶板放在湿盒中37数小时或置电泳槽过夜再观察。思考题1. 进行环状沉淀试验时，注意事项是什么？2. 琼脂扩散沉淀试验的操作方法及其应用。 3. 对流免疫电泳的原理是什么？实验三 溶血试验红细胞与其相应的抗体（溶血素）发生特异性结合，当加入补体时，抗原抗体复合物通过经典途径使补体活化，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应。羊红细胞或鸡细胞 + 免疫血清（溶血素）+ 豚鼠血清（补体） 溶血反应。补体（Complement）是存在于正常人和脊椎动物血清及组织液中一组具有酶原活性的蛋白质，以豚鼠血清中的补体成分较全且活性高。由于

21、补体对热敏感，56 30min即被灭活，室温放置很快失活，0-10其活性仅能保持3-4d，实验时可以采用新鲜的豚鼠血清。目的要求1. 通过溶血试验，掌握抗原、抗体与补体的关系及作用特点，理解和验证补体被激活后的溶细胞作用。2. 掌握溶血试验的操作与观察结果的方法。材料与试剂1. 试管，试管架，可调加样器，滴头，滴管，注射器，针头等。2. 灭菌生理盐水，2% 山羊红细胞悬液，兔抗山羊红细胞抗体（溶血素）， 2% 鸡红细胞悬液，兔抗鸡红细胞抗体（溶血素），豚鼠血清。实验内容及操作方法1. 2% 山羊(或鸡)红细胞悬液的制备：无菌取山羊(或鸡)抗凝血，离心去血浆，沉淀用生理盐水洗涤3次，每次2000

22、r/min，离心10min，然后去掉上清液，血细胞泥用生理盐水配成2% 的红细胞悬液。2. 溶血素的制备：将免疫血清（溶血素）用生理盐水稀释成2单位（1:500-1:1000），56水浴30 min灭活。3. 补体的制备：将新鲜豚鼠血清（补体）用生理盐水稀释成1:20，取1 ml 置56水浴30min灭活。4. 取小试管5支，依次编号。按表3-1加入各成分，摇匀，置37水浴30min。5. 结果观察：若管底无红细胞沉淀，上层液体红色透明者为完全溶血。若液体呈混浊或放置后管底有红细胞沉淀为不溶血。表3-1 溶血试验（单位：ml ）试管号12溶血素对照3补体对照4盐水对照5补、溶对照2%红细胞溶血

23、素补 体 *生理盐水结 果溶血不溶血不溶血不溶血不溶血注：* 56 30min灭活的补体。思考题1. 溶血试验中，第2、3、4、5管是什么对照？为什么要设这些对照？2. 溶血试验的原理是什么？ 实验四 病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 目的要求掌握病毒HA

24、和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。材料与试剂1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50mL定量移液器，滴头，微型振荡器。2. 生理盐水，% 鸡红细胞悬液。3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。实验内容及操作方法（一）血球凝集(HA)试验 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50mL生理盐水。2. 于左侧第1孔加50mL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50mL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50mL；第12孔为红细胞对照。3. 自右至左依次向各孔加入% 鸡红细胞悬液50mL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-

25、1）。表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：mL）孔 号123456789101112病毒稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水505050505050505050505050病毒液5050505050505050505050 %红细胞505050505050505050505050弃50结果观察+-4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（+），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以100% 凝集的病毒最大稀释

26、度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。(二) 血球凝集抑制(HI)试验 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50mL生理盐水。3. 第孔加被检鸡血清50mL，吹吸混合均匀，吸50mL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50mL，稀释度分别为：1:、1:4、1:8 ；第12孔加新城疫阳性血清50mL，作为

27、血清对照。4. 自第1孔至12孔各加50mL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。5. 自第l孔至12孔各加% 鸡红细胞悬液50mL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：mL）孔 号123456789101112血清稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒对照血清对照生理盐水5050505050505050505050被检鸡血清50505050505050505050504单位病毒505050505050505050

28、505050室温中静置 10 min%红细胞505050505050505050505050弃去50 结果观察-+-6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（+），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。以100抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。附 录1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液枸橼酸钠（5H2O） 枸橼酸（H2O） 葡萄糖 氯化钠 双蒸水

29、 加至 100 ml 将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115灭菌10min,4保存备用。2. % 鸡红细胞制备方法先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的15)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成% 鸡红细胞悬液。3. 96孔微量反应板的清洗将浸泡有75% 乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37温箱中干燥。思考题1. HA

30、和HI试验的原理是什么？2. HI试验是不是特异的抗原抗体反应，为什么?3. HA和HI试验有何实际应用意义？实验五 E-玫瑰花环试验动物的T淋巴细胞具有结合红细胞的性质，其分子基础是T细胞表面存在CD2分子，也就是红细胞受体，多数动物的T细胞是绵羊红细胞受体，而豚鼠、马的T细胞是家兔红细胞受体，因此红细胞能粘附到T细胞周围形成一朵玫瑰花样的花环，故取名为E-玫瑰花环（erythrocyte rosettes），即红细胞玫瑰花环，该试验称为E-玫瑰花环试验（erythrocyte rosettes assay）。凡能与红细胞形成E-玫瑰花环的淋巴细胞简称为E-花环形成细胞。该试验可用于计数或分

31、离E-花环形成细胞以及测定机体的细胞免疫状态。目的要求 1. 掌握E-玫瑰花环试验的原理及操作方法。2. 熟悉淋巴细胞的分离方法。材料与试剂1. 试管，离心管，毛细管，吸管，注射器，载玻片，血球计数板，豚鼠，家兔等。2. 淋巴细胞分层液，无钙、镁的Hanks液，肝素液，小牛血清。 3. % 戊二醛溶液：25% 戊二醛溶液0.32ml，Hanks液9.68 ml，用前配制。4. Giemsa-Weight 染色液：液：Weight粉加甲醇60 ml ，研磨混匀；液：Giemsa粉溶于纯甘油33 ml 中，置60温箱，最后加甲醇33 ml 即可；使用时，分别将液和液用pH6.4的PBS稀释1倍。实

32、验内容及操作方法(一) 豚鼠淋巴细胞的制备1. 方法1取豚鼠肝素抗凝血3 ml，沿离心管壁轻轻地加入到 3 ml 的淋巴细胞分层液的上面，使二层液体的界面不相混合；于水平转子离心机中，2000r/min离心20min，离心后分为四层，上层为血浆，此层与分层液液面交界处有一云雾状层，即为淋巴细胞层，云雾状层之下为淋巴细胞分层液，底层主要为红细胞，用毛细管轻轻地把淋巴细胞层吸入另一试管中；用5倍Hanks 液反复洗涤淋巴细胞2次，每次2000r/min 离心10min；若第一次离心后，沉淀的淋巴细胞中有少量红细胞，可加蒸馏水l ml 左右，振摇1min，使红细胞破裂，然后立即加Hanks液4 ml

33、 左右，混匀，2000r/min 离心10min，弃上清液，继续用Hanks液洗涤一次；沉淀的淋巴细胞用Hanks液配成细胞数为5106个/ml的悬液。2. 方法2取豚鼠肝素抗凝血2 ml ，加等量Hanks 液混合，沿离心管壁用毛细管缓缓加于2ml淋巴细胞分层液表面，置水平转子离心机，2000r/min离心20min，用毛细管吸取血浆与分层液之间的乳白色淋巴细胞层，以Hanks 液如上洗涤，再以Hanks液配成细胞数为5106个/ml的悬液。3. 方法3 取豚鼠肝素抗凝血2 ml ，置37水浴中静置30-40min，吸取上层白细胞与血浆的混合液（约1 ml）；于混合液中加Hanks液数毫升，

34、1500r/min离心5-10 min，弃上清，重复用Hanks液洗涤4次，沉淀均匀即为淋巴细胞悬液。 (二) 家兔红细胞（RRBC）的制备1. 心脏采集家兔肝素抗凝血5 ml ，以2000r/min离心10min，弃上清液。2. 用Hanks液反复洗涤红细胞三次，每次2000r/min离心10min ，再以Hanks液配成10% RRBC悬液。（三）E-花环形成细胞1. 取0.1 ml 淋巴细胞悬液，加10% RRBC悬液 ml ， ml 。2. 37水浴15min，600r/min离心5min，吸弃上清液，4作用2-4h。3. 将细胞沉淀轻轻摇起， ml ，混匀后4固定15 min。4.

35、将洁净的载玻片用Hanks液沾湿，滴一小滴细胞悬液，让其自然散开即可。5. 自然干燥后，滴加甲醇固定5min，用Giemsa-Weight 染色液染色，水洗，干燥镜检。6. 结果判断：凡吸附3个以上RRBC的淋巴细胞判为一个E-花环形成细胞。每一标本检查200个淋巴细胞，按下列公式计算E-玫瑰花环形成率。 E-玫瑰花环形成细胞数E-玫瑰花环形成率 = 100% 计数的淋巴细胞总数思考题1. E-玫瑰花环试验的操作方法。2. 为什么可以用E花环试验检测T细胞的数量？ 实验六 EA玫瑰花环试验B淋巴细胞上有免疫球蛋白的Fc受体， 以鸡红细胞作为指示细胞与相应的抗红细胞抗体形成EA，B淋巴细胞可以通

36、过Fc受体与EA结合，形成EA玫瑰花环，在显微镜下可以观察到吸附有红细胞的B淋巴细胞，以此计算B淋巴细胞的数目。Fc受体并非B细胞所特有，中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞表面均有这种受体，但这些细胞可以通过形态学加以区别。此方法简单，目前较常采用，以检测B淋巴细胞的百分率。目的要求1. 掌握EA玫瑰花环试验的原理及操作方法。2. 熟悉淋巴细胞的分离方法。材料与试剂1. 试管，滴管，吸管，注射器，载玻片，盖玻片，血球计数板，鸡，家兔等。2. 淋巴细胞分层液，无钙、镁的Hanks液，肝素液，姬姆萨染色液，1% 戊二醛溶液，95% 乙醇，2%盐酸溶液等。3. 鸡红细胞悬液的制备：由于绵羊红细胞易于与T

37、淋巴细胞形成E-玫瑰花环，造成混淆，所以一般在检测B淋巴细胞时，采用鸡红细胞。从鸡翅下静脉采血，用肝素抗凝，以Hanks液洗涤3次，最后配成4% 的细胞悬液。4. 抗鸡红细胞抗体的制备（溶血素）：参见实验十，溶血素凝集价为1:2000。操作方法1. 分离淋巴细胞，制成2.5 X 106个/ml细胞悬液。2. EA悬液的制备：取4% 鸡红细胞悬液2ml加入试管中，再加等量的1:4000 稀释的溶血素，混匀，37水浴15min，取出后离心，以Hanks液洗2次，再以2ml Hanks液悬浮，即为4%的EA悬液。 l于试管中，加入等量的4% 的EA悬液，混匀，室温作用30min，1000r/min离

38、心5min，吸弃过多的上清液，置4 2-4h。4. 取出后，将沉淀轻轻摇起，加1% 戊二醛溶液l，混匀后置4固定30min。5. 以悬液制片，自然干燥，滴加姬姆萨染色液染色2min，加自来水继续放置15min，冲洗，将玻片置95% 酒精缸腿色15-30S（以脱成浅紫蓝色为度），再置盐酸液缸（按1% HCl 1份与自来水2份）脱色10S左右（呈淡兰略带红色为度），取出冲洗，干燥镜检。6. 结果判定：凡1个淋巴细胞结合3个以上鸡红细胞即为EA花环形成阳性细胞，共计数200个淋巴细胞，计算花环形成率。注意事项1. 加入淋巴细胞与鸡红细胞的比例一般以1:40为宜，（1:30-1:50），淋巴细胞过少，

39、花环形成率明显减少。2. 淋巴细胞、红细胞均应新鲜，否则花环形成率明显下降。思考题1. EA玫瑰花环试验的原理是什么？2. EA玫瑰花环试验的操作方法。实验七 EAC玫瑰花环试验B淋巴细胞表面有补体受体，红细胞可与相应的抗体(溶血素)结合形成抗原抗体复合物(EA)，通过补体经典途径活化补体，而产生活化的C3， C3 与EA及B细胞结合，形成花环，即EAC玫瑰花环，以供计数B淋巴细胞。目的要求1. 熟悉EAC玫瑰花环试验的原理。2. 熟悉EAC玫瑰花环试验的操作方法。材料与试剂1. 基本同EA玫瑰花环试验。2. 补体：当日采集豚鼠混合血清，用Hanks液稀释成1:100，置4保存备用。操作方法1

40、. EAC悬液的制备：取4% 鸡红细胞2ml于试管中，加入1:4000稀释的溶血素2ml，混匀，置37水浴15min，取出后离心，用Hanks液洗涤2次，再以2ml Hanks液稀释沉淀细胞，加1:100稀释的补体2ml，混匀，放置37水浴15min取出，用Hanks液洗涤2次，配成4% EAC细胞悬液。l于试管中，加入4% 的EAC悬液，混匀，室温作用30min，1000r/min离心5min，吸弃过多的上清液，置4 2-4h。3. 固定，制片，染色同EA玫瑰花环试验。4. 结果判定：同EA玫瑰花环试验。注意事项1. 同EA花环形成试验。2. 补体应现用现采集。思考题1. EAC玫瑰花环试验

41、的原理是什么?2. 实验中所需补体为什么现用现采集?实验八 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）是目前发展最快，应用最广泛的一种免疫学检测技术。其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相载体上，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后以肉眼或酶标仪检测结果。通过酶与底物作用呈现颜色的深度，进行定量或定性分析。本试验将抗原抗体反应的特异性与酶的高催化活性相结合，使测定方法达到很高的敏感性，且特异性强，可用于生物活性物质的微量检测及疾病诊断，广泛应用于整个生命科学领域。目的要求1. 掌握酶联免疫吸附试验的原理及基本操作方法。2. 了解猪

42、群猪瘟抗体监测的意义及鸡传染性法氏囊病病毒检测的方法。材料与试剂1. 酶标板，酶联检测仪（酶标仪），微量加样器，滴头（tip头）。）， 0.01mol/L PBST（含0.01%土温20）， 2mol/L H2SO4（包被液），封闭液，邻苯二胺（OPD），3% H2O2，柠檬酸盐缓冲液。3. 猪瘟病毒抗原，兔抗猪IgG酶标抗体，待检血清，猪瘟阳性血清，猪瘟阴性血清。4. 鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）特异性抗体，IBDV抗原，待检IBDV抗原，酶标抗IBDV的单克隆抗体。实验内容与操作方法（一）间接ELISA（以猪瘟抗体的检测为例，该法可用于猪瘟抗体监测）1. 包被：用碳酸盐缓冲液稀释猪瘟病

43、毒抗原至1mg/ml，以微量加样器每孔加样100mL，置湿盒内37包被2-3h。2. 洗涤：以PBST冲洗酶标板，共洗5次，每次3min。3. 加待检血清：每孔加100mL PBS，然后在酶标板的第1孔加100mL待检血清，以微量加样器反复吹吸几次混匀，吸100mL加至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，剩余的100mL弃去，置湿盒内37作用2h。4. 洗涤：同上。5. 加酶标抗体：以PBS将兔抗猪IgG酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加100mL，置湿盒内37作用2h。6. 洗涤：同上。7. 加底物显色：取10ml柠檬酸盐缓冲液，加OPD 4ml和3% H2O2 100 mL，每孔加50mL，置湿盒

44、内避光显色10min。8. 终止反应：每孔加2mol/L H2SO4溶液100mL终止反应。9. 结果判定：以酶标仪检测样品的OD值（波长490nm），先以空白孔调零，当OD2.1即判断为阳性。注意: 每块ELISA板均需在最后一排的后3孔设立阳性对照、阴性对照和空白对照。（二）夹心ELISA（以鸡传染性法氏囊病病毒检测为例）1. 包被：用包被液将IBDV特异性抗体稀释为25-100mg/ml，以100mL/孔的量加入酶标板中，置4过夜吸附或37吸附120min。2. 洗涤：PBST冲洗酶标板，共洗3次，每次3min。3. 封闭：用封闭液封闭，200mL/孔，4过夜或37 120min；PBST洗3次，每次1min。