中药制剂的含量测定技术讲稿.ppt
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1、第一页,讲稿共一百三十九页哦1. 定义 紫外-可见分光光度法(Ultraviolet and Visible Spectrophotometry)系指通过测定被测物质在紫外-可见光区(200760nm)对光的吸光度或发光强度,进行物质定性定量分析的方法。 2. 特点 设备简单、操作简便、灵敏度和准确度较高等。3. 适用范围 中药制剂定性鉴别、杂质检查及含量测定。第二页,讲稿共一百三十九页哦一、仪器工作原理一、仪器工作原理 (一)紫外(一)紫外-可见分光光度仪的构造可见分光光度仪的构造光源单色器吸收池检测器数据处理系统第三页,讲稿共一百三十九页哦 1. 光源(辐射源) (1)可见光光源:为热辐射
2、光源,如卤钨灯、碘钨灯、钨丝灯 (白炽灯)。 (2)紫外光源:多为气体放电光源,如氢、氘、氙放电灯及汞 灯等。 2. 单色器 是能从光源的复合光中分出测量所需波长单色光的光学装置。 (1)棱镜单色器:有玻璃和石英两种材料。是依据光的折射率不同,而将其分成不同波长的单色光。第四页,讲稿共一百三十九页哦(2)光栅单色器:是利用光的衍射和干涉作用制成的。可用于紫外、可见和近红外光谱区域,具有良好的、几乎均匀一致的色散率,且具有适用波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制作等优点,是目前常用的色散元件。缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。 3. 吸收池 又叫比色皿。是用于盛放分析试液并提供一定吸光
3、厚度的器皿。一台分光光度计配有几组厚度不同的吸收池,吸收池的大小规格从几毫米到几厘米不等,最常用的是1厘米的吸收池。 (1)石英池:适用于可见光区及紫外光区。 (2)玻璃吸收池:只能用于可见光区。第五页,讲稿共一百三十九页哦 4.检测器 是通过光电转换元件检测透过光的光通量大小,并将光信号转变成电信号的装置。 检测器应在测量的光谱范围内具有高的灵敏度;线性关系好、线性范围宽;对不同波长的辐射响应性能相同且可靠;有好的稳定性和低的噪音水平等特点。 (1)光电池:常用的光电池有硒电池和硅光电池。 (2)光电管:它以一弯成半圆柱且内表面涂上一层光敏材料的镍片作为阴极,而置于圆柱形中心的一金属丝作为阳
4、极,密封于高真空的玻璃或石英中构成的,当光照到阴极的光敏材料时,阴极发射出电子,被阳极收集而产生光电流。真空光电二极管真空光电二极管 第六页,讲稿共一百三十九页哦(3)光电倍增管:光电倍增管是一种加上多级倍增电极的光电管,其外壳由玻璃或石英制成,阴极表面涂上光敏物质,在阴极、阳极间装有一系列次级电子发射极,D1、D2等。光电倍增管工作原理图光电倍增管工作原理图 第七页,讲稿共一百三十九页哦 5. 信号指示系统 是把检测到的信号以适当的方式显示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。常用的显示方式有数字显示、荧光屏显示、曲线扫描及结果打印等多种。
5、高性能的仪器还带有数据站,即可对分光光度计进行操作控制,又可进行数据处理。 第八页,讲稿共一百三十九页哦(二)紫外(二)紫外- -可见分光光度计的工作原理可见分光光度计的工作原理 1. 单光束分光光度计的工作原理 国产722型、751 型、724型、英国SP500型以及Backman DU-8型等均属于此类光度计。光学系统工作原理图光学系统工作原理图 第九页,讲稿共一百三十九页哦单波长双光束分光光度计原理图单波长双光束分光光度计原理图 2. 单波长双光束分光光度计的工作原理 仪器有国产710型、730型、740型等。第十页,讲稿共一百三十九页哦 3. 双波长分光光度计的工作原理 紫外分光光度计
6、(200400nm)、可见分光光度计(400800nm)和紫外-可见分光光度计(2001000nm)。双波长分光光度计光路示意图双波长分光光度计光路示意图 第十一页,讲稿共一百三十九页哦 二、仪器操作通法二、仪器操作通法(一)操作通法(一)操作通法 1. 仪器接通电源,预热。 2. 根据测定波长,选择相应光源,继续预热(各型号仪器在操作顺序上略有区别)。 3. 灵敏度钮置1档。 4. 将盛有供试品溶液及空白(参比)溶液的吸收池放入吸收池架,使空白(参比)溶液置光路位置,盖好供试品室盖。 5. 量程选择钮置T位置。第十二页,讲稿共一百三十九页哦 6. 断开光路调节仪器零点,使显示为0。打开光路调
7、节仪器透光率,使显示为100%。 7. 量程选择钮置A位置。 8. 将供试品置于光路中,读取供试品的吸光度值。 9. 仪器使用完毕,取出吸收池,关机,登记。 10. 不同型号的紫外分光光度计其操作方法和要求亦有所不同,使用前应详细阅读使用说明书。第十三页,讲稿共一百三十九页哦(二)注意事项(二)注意事项1. 量瓶、移液管及吸收池 均应经洗净、校正后使用。2. 吸收池的校正 3. 吸收池使用方法 使用前的处理;吸收池使用;使用后的处理。4. 狭缝宽度的选择 5. 吸光度的测定6. 制剂含量的测定第十四页,讲稿共一百三十九页哦 三、含量测定三、含量测定(一)基本原理(一)基本原理紫外-可见分光光度
8、法的定量分析依据是朗伯-比尔定律。 数学表达式为:A=KCL A为吸光度;K为吸收系数;C为溶液浓度;L为液层厚度。吸收系数:百分吸收系数、摩尔吸收系数。中国药典采用百分吸收系数。第十五页,讲稿共一百三十九页哦(二)操作步骤 1. 对照溶液品与供试品溶液的制备 2. 紫外可见分光光度计的校正 (1)波长准确度的校正吸光度准确度的标准范围波长(nm)吸收强度百分吸收系数相对偏差范围235257313350最小最大最小最大124.5 144.0 48.62 106.6 123.0126.0142.5146.047.050.3105.5108.5第十六页,讲稿共一百三十九页哦(2)吸光度的校正铬酸钾
9、溶液的吸光度/nm吸光度A/nm吸光度A/nm吸光度A/nm吸光度A200.45593100.15183800.92814600.01732300.16753100.04583900.68414700.00832400.29333200.06204000.38724800.00352500.49623300.14574100.19724900.00092600.63453400.31434200.12615000.00002700.74473500.55284300.0841 2800.72353600.82974400.535 2900.42953700.99144500.0325 第十七页
10、,讲稿共一百三十九页哦(3)杂散光的检查 杂散光的检查试剂名称试剂浓(g/100ml)测定用波长(nm)透光率(%)碘化钠亚硝酸钠1.00 5.002203400.80.8第十八页,讲稿共一百三十九页哦 3. 选择测量条件 显色反应的条件、消除干扰物质的方法、测量波长、参比溶液、及测量波长、吸光度范围及仪器狭缝宽度的选择。 4. 进样测试 5. 含量计算第十九页,讲稿共一百三十九页哦 (三)含量测定的方法(三)含量测定的方法 1. 单组分样品的定量分析 (1)吸收系数法:按药品标准规定的方法配制供试品溶液,在规定的波长处测定其吸光度(A),根据A=KCL与药品标准规定的被测物质的百分吸收系数,
11、 计算供试品溶液的浓度C供(g/100ml)。 含量(含量(W/W)=C供供D供供V样样100W供供第二十页,讲稿共一百三十九页哦 如中国药典驻车丸中总生物碱的含量测定、前列舒丸中牡丹皮的含量测定等采用本法。先计算C供,再计算出药品中被测成分的含量(W/W)。含量计算公式有两种:含量(含量(mg/丸)丸)=C供供(mg/ml)D供供V样样(ml)平均丸重(平均丸重(g/丸)丸)W样样(g)含量(标示量含量(标示量%)=C供供(mg/ml)D供供V样样(ml)平均丸重(平均丸重(g/丸)丸)W样样(g)标示标示含量(含量(mg/丸)丸)100% 第二十一页,讲稿共一百三十九页哦 (2)对照品比较
12、法:按药品标准的规定,在相同条件下,在规定波长处分别测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度,按 计算供试品溶液中待测组分的浓度。 式中:AR为对照品溶液的吸光度;AX为供试品溶液的吸光度;CR为对照品溶液的浓度;CX为供试品溶液的浓度。中国药典华山参片中生物碱的含量测定、黄杨宁片中环维黄杨星D的含量测定均采用本法。第二十二页,讲稿共一百三十九页哦(3)标准曲线法(工作曲线法):配制一系列不同浓度的对照品溶液,选择合适的参比溶液,在相同条件下分别测定各对照品溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标绘制A-C曲线,称为标准曲线或工作曲线。然后在完全相同的条件下测定样品溶液的吸光度,从标准曲线(或回
13、归直线)上查出样品溶液的对应浓度,或代入回归方程,求出样品溶液的浓度。标准曲线 第二十三页,讲稿共一百三十九页哦 在做精密测量时,用对照品溶液的浓度进行线性回归,求出回归直线方程(相关系数r0.999),绘出回归直线代替标准曲线,以尽量消除偶然误差。 亦可利用计算器将一系列对照品溶液的浓度与相应的吸光度进行一元线性回归,求出回归方程(相关系数0.9990),将供试品溶液的吸光度代入回归方程,算出供试品溶液的浓度。 回归方程:A=a+bC 式中,A为被测溶液吸光度;C为被测溶液浓(g/ml);a为截距;b为斜率。 中国药典槐米中芦丁及青黛中靛蓝的含量测定,复方皂矾丸中的硫酸亚铁,独一味胶囊、益心
14、酮片、消咳喘糖浆和排石颗粒中的总黄酮,桂林西瓜霜中的总生物碱的含量测定等均使用该法。第二十四页,讲稿共一百三十九页哦 2. 混合物的测定方法混合物的测定方法 当待测组分彼此不发生化学反应时,根据吸收定律的加和性,不需化学分离,可同时测定样品中两种或多种组分的含量。 当溶液中同时存在两组分a和b时,它们的吸收峰相互重叠的程度有三种情况,如图所示。混合组份吸收光谱重叠示意图 第二十五页,讲稿共一百三十九页哦 (1)在最大吸收峰处互不重叠:如图 (1),可分别在1和2处用单组分样品的测定方法,先后测定组分a和b的浓度。 (2)在最大吸收峰处部分重叠:如图 (2),在1处,组分b无吸收,在2处,组分a
15、和b均有吸收。则可先在1处用单组分样品的测量方法,测定样品溶液中组分a的浓度;然后在2处测定样品溶液的吸光度Aab2,根据吸光度的加和性原则,计算组分b的浓度。 (3)两组分在最大吸收峰处相互重叠:如图 (3),常采用解线性方程组法。选择两个测定波长1和2,首先测定两组分在两波长处的吸收系数的值,然后在两波长处测定样品溶液的吸光度,最后用解线性方程组的方法求出两组分的浓度。第二十六页,讲稿共一百三十九页哦(4)等吸收双波长测定法:对于图 (3)的情况,可利用等吸收双波长测定法对其中一种组分或两种组分同时进行测定。操作步骤:选择参比与测定波长;绘制标准曲线;含量测定等吸收双波长测定法示意图 第二
16、十七页,讲稿共一百三十九页哦 (5)导数光谱法:导数光谱法又称微分光谱法,是一种消除光谱干扰的方法。以吸光度A对波长的吸收光谱称为零阶光谱,对吸收光谱进行一级微分,即可得到(dA/d)-曲线,称为一阶导数光谱,以同样方法可得到二阶导数光谱(d2A/d2)-曲线,三阶导数光谱(d3A/d3)-曲线,四阶导数光谱(d4A/d4)-曲线。各阶倒数光谱的基本曲线图1.零阶 2.一阶 3.二阶 4.三阶 5.四阶第二十八页,讲稿共一百三十九页哦 原理:在导数光谱中,导数信号与浓度成正比,即:dA/dC,d2A/d2C,d3A/d3C,d4A/d4C。信号对浓度的灵敏度取决于吸收系数在特定波长下的变化率,
17、即:d/d,d2/d2, d3/d3, d4/d4,导数光谱的测量法有几何法和代数法。在几何法中,导数光谱的定量参数是振幅。 导数光谱的微分阶数n越大,峰形越尖锐、分辨率越强,但信噪比将降低,通常不超过四阶。 操作步骤:干扰情况考查;选择测定条件;绘制标准曲线;样品测定。第二十九页,讲稿共一百三十九页哦 (6)差示光谱法(A)法:先选定一个理想的参比溶液,使待测组分发生特征光谱变化,而共存组分不发生光谱变化,由此消除其干扰。一般是取两份相等的供试液,在一份中加酸或碱,形成不同的酸碱介质环境;或加入能与待测组分发生反应的试剂,使待测组分以不同的形式存在,吸收光谱发生显著变化,将两份供试液稀释至同
18、样浓度,分别置于样品池与参比池中,于选定波长处测其吸光度差值A,在一定浓度范围内,A与待测组分浓度C呈线性关系,可作为物质定量分析的依据。第三十页,讲稿共一百三十九页哦 原理:导数光谱的微分阶数n越大,峰形越尖锐、分辨率越强,但信噪比将降低,通常不超过四阶。导数光谱的波长间隔越大,灵敏度越高,但分辨率降低。一般选12nm为宜。导数光谱的中间波长m的选择原则是:干扰组分在此波长处的导数值最好为零,而且通过选择适宜的波长和求导条件,可消除背景吸收、杂质和共存物的干扰。 操作步骤:干扰情况考查;选择测定条件;绘制标准曲线;供试品测定;第三十一页,讲稿共一百三十九页哦 四、案例四、案例(一)六味地黄颗
19、粒中牡丹皮的含量测定(一)六味地黄颗粒中牡丹皮的含量测定供试品溶液的制备供试品溶液的制备参比溶液的制备参比溶液的制备紫外紫外分分光光度计光光度计含量计算含量计算 取本品约2g,精密称定,用水蒸气蒸馏,收集馏出液约450ml,置500ml量瓶中,加水稀释至刻度。照紫外分光光度法,在274nm波长处测定吸光度,按丹皮酚(C9H10O3)的吸收系数为862计算,即得。本品每袋含牡丹皮按丹皮酚(C9H10O3)计,不得少于6.0mg。第三十二页,讲稿共一百三十九页哦(二)独一味胶囊中总黄酮的含量测定(二)独一味胶囊中总黄酮的含量测定 本品每粒含总黄酮以无水芦丁(C27H30O16)计,不得少于26mg
20、。u独一味胶囊中总黄酮的含量测定采用的是何种方法独一味胶囊中总黄酮的含量测定采用的是何种方法 ?u 供试品溶液是如何制备的?供试品溶液是如何制备的?对照品溶对照品溶液的制备液的制备标准曲线标准曲线的的 制备制备吸光度吸光度的测定的测定含量含量计算计算供试品溶供试品溶液的制备液的制备课堂互动课堂互动第三十三页,讲稿共一百三十九页哦 (三)黄杨宁片中黄杨宁的含量测定(三)黄杨宁片中黄杨宁的含量测定 药品标准规定每片含黄杨宁以环维黄杨星D(C26H46N2O)计算,应为标示量的90.0%110.0%。供试品溶供试品溶液的制备液的制备对照品溶对照品溶液的制备液的制备吸光度吸光度的测定的测定含量含量计算
21、计算u黄杨宁片中黄杨宁的含量测定采用的是何种方法黄杨宁片中黄杨宁的含量测定采用的是何种方法 ?u 供试品溶液是如何制备的?供试品溶液是如何制备的?课堂互动课堂互动第三十四页,讲稿共一百三十九页哦 1.定义 薄层扫描法是供试品经薄层分离后,用一束波长、强度一定的紫外线或可见光对薄层板进行扫描,通过测定薄层板上的斑点对光的吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度,将扫描得到的图谱及积分数据进行定量的方法。 2.特点 设备简单、操作方便、分离快速、灵敏度及分辨率高、显色剂选择范围广、适用于多组分及微量组分定量等。第三十五页,讲稿共一百三十九页哦 一、仪器工作原理一、仪器工作原理 (一)薄层色谱扫描法的
22、基本原理(一)薄层色谱扫描法的基本原理 薄层色谱扫描法的测定原理是用长宽可以调整的一束波长、强度固定的光,对薄层板上的斑点进行扫描,通过测量斑点或被斑点反射的光束的强度变化,求出待测组分含量。薄层扫描法可分为吸收薄层扫描法和薄层荧光扫描法。第三十六页,讲稿共一百三十九页哦 1. . 吸收薄层扫描测定法吸收薄层扫描测定法 是用可见-紫外光的单色光对薄层板上色谱斑点进行扫描,根据扫描获得的吸光度随展开距离变化的图谱及积分数据进行定量的方法。根据测光的方式不同,吸收扫描测定法又分为透射法和反射法两种。 透射法是测定光透过供试品斑点后的吸收情况进行的定量方法透射法扫描 L-光源 MC-单色器 P-薄层
23、板 S-斑点 PD-检测器第三十七页,讲稿共一百三十九页哦 反射法是测定供试品斑点对光的反射情况进行的定量方法。 L-光源 MC-单色器 P-薄层板 S-斑点 PD-检测器反射法扫描 第三十八页,讲稿共一百三十九页哦吸光度与物质的浓度及液层厚度间不呈线性关系的解决方法选择曲线中的直线部分进行定量分析 采用Kubelka-Munk方程 利用非线性方程定量 第三十九页,讲稿共一百三十九页哦 2. 薄层荧光扫描法薄层荧光扫描法 是通过仪器对供试品吸收可见-紫外光后发射的荧光强度扫描得到的吸收光谱及积分数据,求出供试品含量的方法 荧光反射法扫描L-光源 MC-单色器 P-薄层板 S-斑点 PD-检测器
24、第四十页,讲稿共一百三十九页哦 当样品量很少时,斑点中组分的浓度与荧光强度呈线性关系,可按公式计算:F=2.3K/IoECL 或 F=KC 式F=2.3K/IoECL中:F为荧光强度;Io为入射光强度;C为浓度;E为吸收系数;K为常数(与荧光效率有关);L为薄层厚度。 式式F=KC 中:中: C为浓度; K为2.3K/IoEL之积。 在薄层荧光扫描法中, 常用斑点荧光强度的积分值(色谱峰面积)代替公式中的F,斑点中组份的含量代替公式中的C进行计算。第四十一页,讲稿共一百三十九页哦(二)薄层扫描仪的构造(二)薄层扫描仪的构造 薄层扫描仪主要由主机(光源、单色器、供试品室、薄层板台架、检测器)及工
25、作站组成。 1.光源 光源室能提供稳定的、具有一定强度的所需波长范围内的连续光源。包括紫外光源氘灯(200nm370nm);可见光源钨灯(370nm700nm);荧光光源氙灯或汞灯(200nm700nm),其中汞灯为线光源,可提供特征辐射光谱。第四十二页,讲稿共一百三十九页哦 2.单色光器 单色光器可以将光源发出的连续光分解为单色光。其主要由入射狭缝、出射狭缝、色散元件、平行光装置(准直镜)等部分构成。薄层扫描仪多采用光栅为色散元件。 3.薄层板台 包括薄层板台架及驱动装置。 4.检测器 检测器是用来检测和放大由供试品斑点透射、反射或发出荧光强度的装置。 5.工作站 具有设定仪器参数、控制仪器
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