低强度超声联合iPSCs源性神经嵴干细胞对周围神经损伤修复的作用.doc

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1、低强度超声联合iPSCs源性神经嵴干细胞对周围神经损伤修复的作用摘 要目前周围神经损伤在人群中发病率较高，在世界范围内影响着超过百万人的生活状态。压迫、撕裂等外伤或局部缺血等因素都可能引起神经系统部分或全部损伤，从而引起运动、感觉和自主功能的丧失，甚至神经元死亡。随着科学技术的发展，多种治疗方法的使用使得周围神经损伤的修复效果得到明显的提高，但离神经系统真正的形态和功能重建还相差甚远，因此急需一种有效且无副作用的治疗方法用于周围神经损伤的修复。在课题组前期研究基础上，本文以诱导性多潜能干细胞源性神经嵴干细胞(induced pluripotent stem cells derived neur

2、al crest stem cells, iPSCs-NCSCs)为种子细胞，以聚左旋乳酸(poly(L-lactic acid), PLLA)为材料制备组织工程神经导管，联合低强度超声(low intensity pulsed ultrasound, LIPUS)刺激，以大鼠坐骨神经断裂为模型，在体探索LIPUS联合iPSCs-NCSCs对周围神经损伤修复的作用，重点考察了LIPUS联合iPSCs-NCSCs对周围神经损伤之后坐骨神经功能指数(sciatic function index, SFI)、静态坐骨神经功能指数(static sciatic index, SSI)、坐骨神经传导速度

3、(nerve conduct velocity, NCV)以及组织形态学方面功能恢复的影响。主要研究工作和实验结果如下： 组织工程神经导管的制备通过电纺技术制备PLLA纳米纤维支架，分别利用场发射环境扫描电镜(field emission scanning electron microscope, FESEM)和Image-Pro Plus测定支架表面特征和计算纤维直径、利用INSTRON-E1000拉伸机测定PLLA导管的力学性能，以及LIVE/DEAD试剂盒检测PLLA组织工程神经导管中iPSCs-NCSCs的活性。结果显示所得PLLA纳米纤维呈现出较好的纵向排列性，其直径为251.655

4、9.37 nm，PLLA神经导管的弹性模量为34.490.47 MPa，抗拉强度为1.860.21 MPa，并且PLLA神经组织导管中细胞存活率超过95%。 LIPUS联合iPSCs-NCSC对周围神经损伤修复的影响20只200-250 g的SD大鼠用于建立坐骨神经缺损10 mm动物模型。实验共分成五组，包括自体移植组(标记为Autograft)、PLLA空导管组(标记为C)、PLLA空导管联合低强度超声组(标记为C/LIPUS)、PLLA导管植入iPSCs-NCSC细胞组(标记为C/iPSCs)以及PLLA导管植入iPSCs-NCSC细胞并联合低强度超声组(标记为C/iPSCs/LIPUS)

5、，其中Autograft组为对照组。超声刺激处理时实现固定频率(1 MHz)、占空比(Duty cycle) (20%)、脉冲重复频率(Pulse repetition frequency, PRF) (100 Hz)的体外辐射，其强度为0.3 W/cm2，每次刺激时间为5分钟，共持续2周。分别通过术后大体观察，术后一个月和三个月的SFI、SSI检测，术后三个月的NCV检测以及形态学组织学检测以分析LIPUS联合种子细胞iPSCs-NCSCs对周围神经损伤修复的影响。大体观察发现，术后一个月观察患趾伤口发现偶有溃烂，术侧肌肉萎缩严重，饮食、自由活动状况良好；三个月无溃烂发生，饮食、自由活动状况

6、良好，肌肉萎缩较轻，术后三月解剖发现无明显炎症反应。术后一个月和三个月的SFI、SSI以及NCV结果显示，各实验组的功能恢复效果较自体移植组差(P95% of iPSCs-NCSCs survived in the PLLA nerve conduits. Effects of LIPUS combined with iPSCs-NCSCs on repair of peripheral nerve injury20 adult female SD rats weighing 200-250 g were used to establish 10 mm defect model of peri

7、pheral nerve injury. All the animals were divided into five groups randomly, which includedthe group of Autograft as control, the group of PLLA conduits without cells (represented as C), the group of PLLA conduits applied low intensity pulsed ultrasound without cells (represented as C/LIPUS), the gr

8、oup of PLLA conduits seeded with iPSCs-NCSCs (represented as C/iPSCs) and the group of PLLA conduits applied low intensity pulsed ultrasound and seeded with iPSCs-NCSCs (represented as C/iPSCs/LIPUS). LIPUS stimulation was applied with fixed frequency (1 MHz), duty ratio (20%), pulse repetition freq

9、uency (PRF) (100 Hz), ultrasonic intensity (0.3 W/cm2). The treatment was 5 minutes a day over a period of 2 weeks.Effects of LIPUS combined with iPSCs-NCSCs on repair of peripheral nerve injury were measured through gross observation, SFI and SSI at 1 and 3 months after surgery, NCV and the morphol

10、ogical histology assessment at 3 months after surgery. Gross observation results showed that ulceration occurred occasionally and the muscle atrophy in operated side was serious at 1 month after surgery. These conditions were alleviated at 3 month after surgery. No obvious inflammation reaction was

11、observed in grafts after anatomy at 3 month. The outcome of SFI, SSI and NCV indicated that although all the experiment groups was less efficiency than Autograft group (P0.05), the function recovery of the group C/iPSCs/LIPUS was better than other three groups. On the other hand, under the same cond

12、ition, the function recovery of the groups stimulated by LIPUS were more efficiency than those groups with sham LIPUS treatment.The results of Hematoxylin/eosin (HE) staining and Bielschowsky staining suggested that compared to group C, group C/LIPUS and group C/iPSCs, the regeneration of angiogenes

13、is and nerve fibers were observed in group Autograft and group C/LIPUS/iPSCs. Besides, under the same condition, the number of regenerated angiogenesis and nerve fibers of the groups stimulated by LIPUS were more than those groups with sham LIPUS treatment. As the immunofluorescence of S100, which w

14、as the marker of Schwann cells, the density in group Autograft, group C/iPSCs and C/LIPUS/iPSCs was higher when compared with group C and group C/LIPUS.In summary, 0.3 W/cm2 LIPUS combined with iPSCs-NCSCs could accelerate the regeneration of nerve after injury, which showed that this study hadsome

15、clinical significance in exploring efficient methods for peripheral nerve repair.Keywords：Peripheral nerve repair, Tissue engineering, Low intensity pulsed ultrasound, Induced pluripotent stem cells-neural crest stem cells, Nerve conduit目 录中文摘要I英文摘要III目 录VII英汉缩略词表IX1 绪论11.1 周围神经损伤11.2 用于周围神经损伤修复的组织工

16、程方法21.2.1 用于周围神经损伤修复中的神经导管31.2.2 用于周围神经损伤修复中的种子细胞51.2.3 低强度超声在周围神经损伤修复中的应用81.3 研究意义101.4 本文研究的目的和研究内容101.4.1 本文研究的目的101.4.2 本文的主要研究内容101.4.3 技术路线102 PLLA组织功能神经导管的制备122.1 引言122.2 材料与试剂122.2.1 实验细胞122.2.2 实验仪器及耗材122.2.3 实验试剂132.2.4 主要试剂的配制142.3 实验方法142.3.1 iPSCs-NCSCs的培养142.3.2 PLLA纳米纤维的制备及其表面特征检测162.

17、3.3 PLLA纳米导管的制备及其力学强度检测162.3.4 PLLA神经导管的制备162.4 实验结果172.4.1 iPSCs-NCSCs的培养和外形特征172.4.2 PLLA纳米纤维支架表面特征182.4.3 PLLA纳米导管表面和力学特征182.4.4 PLLA神经导管中细胞活性192.5 讨论与分析202.6 本章小结213 LIPUS联合iPSCs-NCSCs对周围神经损伤修复的影响223.1 引言223.2 材料与仪器223.2.1 实验细胞与实验动物223.2.2 实验仪器及耗材223.2.3 实验试剂233.2.4 主要试剂的配制方案233.3 实验方法243.3.1 细胞

18、培养243.3.2 PLLA神经导管制备243.3.3 动物饲养243.3.4 实验动物分组243.3.5 动物模型建立243.3.6 超声刺激253.3.7 大体观察263.3.8 步态分析273.3.9 坐骨神经传导速度检测273.3.10 冰冻切片273.3.11 HE检测283.3.12 Bielschowsky神经纤维染色283.3.13 S100免疫荧光染色293.3.14 数据分析293.4 实验结果293.4.1 大体观察293.4.2 坐骨神经功能指数检测303.4.3 大鼠坐骨神经传导速度检测313.4.4 HE染色结果323.4.5 Bielschowsky神经纤维银染3

19、33.4.6 S100免疫荧光染色343.5 分析与讨论353.6 本章小结394结论与展望404.1 主要结论404.2 后续工作展望40致 谢41参考文献40附 录50A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录50B. 作者在攻读学位期间参与的科研项目目录50英汉缩略词表英文缩写英文全称中文名称PLLAPoly(L-lactic acid)聚左旋乳酸PGAPoly(glycolic acid)聚乙醇酸PCLPolycaprolactone聚己内酯PLGAPoly(L-lactic-co-glycolic acid)聚乳酸/羟基乙酸共聚物FDAFood and Drug Administrati

20、on美国食品药品管理局TETissue engineering组织工程学ECMExtracellular matrix细胞外基质SCsSchwann cells施旺细胞ESCsEmbryonic stem cells胚胎干细胞SSCsSomatic stem cells成体干细胞iPSCsInduced pluripotent stem cells诱导性多潜能干细胞NSCsNeural stem cells神经干细胞BMSCsBone marrow derived stem cells骨髓间充质干细胞ADSCsAdipose-derived stem cells脂肪干细胞HUCPVSCHuma

21、numbilical cord perivascularstem cell人体脐带血管周干细胞HSCsHepatic stem cells肝干细胞HFSCsHair follicle stem cells毛囊干细胞MEFMouse embryonic fibroblast老鼠胚胎成纤维细胞NCSCsNeural crest stem cells神经嵴干细胞LIPUSLow intensity pulsed ultrasound stimulation低强度超声刺激iPSCs-NCSCsInduced pluripotent stem cells- derived neural crest st

22、em cells诱导性多潜能干细胞来源的神经嵴干细胞bFGFBasic fibroblast growth factor碱性成纤维细胞生长因子CMAPsCompound muscle action potentials复合肌肉动作电位EGFEpidermal growth factor表皮生长因子mgMilligram毫克mLMilliliter毫升molMole摩尔NTNeurotrophin神经营养因子PRFPulse repetition frequency脉冲重复频率RARetinoic acid维甲酸rpmRevolutions per minute转/每分钟RT-PCRRevers

23、e Transcription PCR逆转录聚合酶链反应gMicrogramme微克NGFNerve growth factor神经生长因子BDNFBrain derived nerve growth factor脑源性神经生长因子TGFTransforming growth factor转化成长因子GDNFGlial cell line-derived neurotrophic factor神经胶质细胞源性的神经营养因子CNTFCiliary neurotrophic factor睫状神经生长因子SKPsSkin derived precursors皮肤来源的前体细胞SFISciatic f

24、unction index 坐骨功能指数SSIStatic sciatic index 静态坐骨功能NCVNerve conduct velocity神经传导速度FESEMField emission scanning electron microscopy 场发射环境扫描电镜HEHematoxylin/eosin苏木素-伊红染色SVRSurface area to volume ratio比表面积hMSCsHumanmesenchymal stem cells人源间充质干细胞MRIMagnetic resonance imaging磁共振成像CTComputed tomography计算机断

25、层扫描DPSCsDental pulp stem cells牙髓干细胞PTFEPolytetrafluroethylene聚四氟乙烯ePTFEexpanded polytetrafluroethylene膨体聚四氟乙烯1 绪论1.1 周围神经损伤周围神经损伤是一种较为常见的临床疾病，牵拉、撞伤、切割、压迫、烧伤、药物注射、缺血以及肿瘤等因素均可引起周围神经的损伤，其恢复程度受到年龄、损伤机制、损伤程度、损伤持续时间以及损伤部位等的影响。十二五规划以来，其发病率也在逐年上升，即使经过较为及时和科学的治疗，患肢能够得到一定程度的恢复，但依然会留下感觉障碍、畸形甚至瘫痪等程度不一的后遗症，对患者的生

26、理和心理带来深远且持久的影响1。因此，临床中急需要找到一种既行之有效又能够对机体无副作用的方法来修复周围神经的损伤，进而能够解决周围神经损伤所引起的经济和心灵等一系列问题。按其损伤的程度不同，学者将周围神经损伤划分为神经失用、轴突断裂、神经断伤、神经断伤+以及神经断伤+五种2-4(如图1所示)，其中神经断伤类的损伤较为严重，当神经断伤发生时，轴突的细胞体因为修复机制的需求而加快新陈代谢，此时，一些神经细胞为了响应轴突远端部位的代谢信号而凋亡，使损伤的程度加剧。当神经断伤发生时，其修复过程必须依赖手术才能完成，并且其修复难度也相对较大。自神经断伤的修复被关注以来，各国科学家一直在寻求不同的周围神

27、经修复的方法。图1.1 周围神经损伤类型4Fig. 1.1 The types of peripheral nerve injury41.2 用于周围神经损伤修复的组织工程方法在周围神经的修复方法中，当神经损伤较轻或者断伤神经距离较短时，多采用神经缝合或者神经移位的方式进行损伤修复。待修复的神经损伤较大时，神经缝合或者神经移位中的手术将沿着缝合线产生过度的张力而出现水肿、髓鞘脱落以及轴突退变等现象，导致损伤后的功能恢复较慢。临床上对于损伤距离较长或伤势较严重的损伤神经，多采用神经桥接的方法。目前，自体神经移植是用于神经损伤修复最经典的桥接方法，被誉为神经损伤修复的“金标准”。与人造物相比，自体

28、移植能够为近端到远端的神经再生提供结构性的引导作用，且具有更好的组织相容性，毒性较低，能更好的对细胞的粘附以及移行给予支撑。已有较多文献表明，与常规方法相比，通过自体移植进行修复后，移植物中再生的有髓神经纤维数目、髓鞘厚度以及轴突直径等都得到了较为显著的升高5-7。然而由于固有的一些缺点，自体神经移植在临床上的应用受到一定程度的限制，包括： 供体神经数量有限； 需要进行供体位点提取组织以及受体部位的缝合两次手术，增加实验的复杂性； 供体位点可能会发生病变或功能性降低等现象，例如瘢痕以及神经瘤的形成等； 供体与受体神经之间易发生尺寸与神经束等的错配现象从而降低损伤修复效果； 可能会引发感染和神经

29、瘤的发生8。同种异体神经移植也被用于神经修复，但较强的免疫排斥、交叉感染、供体有限等因素使其在临床应用中受到限制。一个多世纪的技术发展使得组织工程方法的出现有望替代自体移植用于周围神经损伤的修复9, 10。图1.2 周围神经修复方法(修改自11)Fig. 1.2 Method for peripheral nerve repair (Modificated from 11)1.2.1 用于周围神经损伤修复中的神经导管作为神经组织的替代物，神经导管为神经再生修复中断裂神经两端的桥接提供了多种有利的条件： 可暂时固定缺损神经的两端并给予支持， 可引导神经元轴向生长， 可富集神经再生所需的生长因子，

30、 可减少细胞的入侵发生炎症反应等。因此，如何制备出理想的神经导管已成为周围神经损伤的修复方法中研究的重点12, 13。基于材料的不同性质，目前应用于临床的神经导管可被分为以下三种： 生物衍生材料神经导管， 非生物降解材料神经导管， 可生物降解材料神经导管8, 11。生物衍生材料神经导管主要包括血管、肌肉、静脉管以及去细胞化的同种异体神经等组织，他们的出现解决了自体移植物的来源受限问题，这些组织的管腔中含有一些与Schwann cells (SCs)基底膜类似的成分，包括层粘连蛋白以及胶原等物质，他们为SCs的迁入提供了有利的环境，通过促进组织中细胞与支架的交互作用而促进轴突的生长，而且由于来源

31、可取自病人自身，能够降低免疫排斥反应。其中血管在周围神经损伤治疗中应用较为广泛，他们多从手背上的组织获得而用于尺神经、中等长度断裂的神经等的治疗。而去细胞化的神经导管中含有三维的胶原支架，能够促进细胞的迁移、神经纤维伸长以及生长因子的分泌等，然而，虽然生物材料导管在周围神经修复研究中取得了一定的成果，但仍然存在一些问题，比如他们的力学性能较难把握和控制，再缺血后会发生坍塌，使得再生神经发生粘连以及引起供体部位出现病灶反应等不良现象，对周围神经的修复过程产生不利的影响14, 15。非降解材料的导管主要包括硅导管、碳纤维管、以及由聚四氟乙烯(polytetrafluroethylene, PTFE

32、)，膨体聚四氟乙烯(expanded polytetrafluroethylene, ePTFE)、聚氯乙烯、聚丙烯聚合物、聚酯纤维、聚乙烯等材料制备的导管16。他们在神经再生过程中起到了一定的通道作用，具有一定的力学强度，能够抵抗神经再生过程中产生的负荷。但在修复过程中，这些材料会因不能降解而以异物形式在原位留存，从而引起机体慢性异物排斥反应，大量的神经纤维化以及瘢痕组织随之形成，使得轴突生长以及神经传导的速率降低，并最终影响周围神经的修复效果4。生物可降解聚合物材料的出现弥补了不可降解材料的缺点而能够更好的用于临床上对周围神经损伤的修复，主要包括聚左旋乳酸(poly(L-lactic ac

33、id), PLLA)、聚乙醇酸(poly(glycolic acid), PGA)、聚己内酯(polycaprolactone, PCL)、聚乳酸己内酯以及聚乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(L-lactic-co-glycolic acid), PLGA)等16, 17。它们一方面可在合理的时间范围内降解并生成可被机体吸收的降解产物，另一方面引起的异物反应程度较轻微，不会对机体造成较大伤害。另外，这些聚合物材料的降解速率可以通过制备条件的不同而改变，而不影响其本身的性质，并且，这些聚合物可制备成多种形式以便用于不同损伤组织的修复。一定的力学强度使得这些材料制备的神经导管在桥接过后管腔不易塌陷，

34、而瘢痕干扰作用的减少使得神经近端再生的轴突能够顺利的通过导管，进而跨越缺损而长入神经远端，从而完成神经修复。为了更好的修复损伤的周围神经，需要构建出理想的修复材料，即该材料应易制备且无毒、具有良好的生物相容性、良好的渗透性和选择通透性、降解可与神经恢复同步且能够降解完全、一定的生物力学性能以支持与断端神经的缝合、一定的弹性以抵抗神经的坍塌、良好的表面特性或电学性质、能够诱导神经的再生并能够阻止成纤维细胞和炎症细胞的侵入11, 18。在此修复材料基础上，对其进行多孔性、渗透性、多通道或者导电性等物理和化学修饰，通过将此种修饰过的导管结合种子细胞(支持细胞)、胞外基质成分以及生长因子等共同构建出更

35、有利于神经损伤修复的组织工程导管(如图1.2所示)。在生物可降解神经导管的制备过程中，静电纺丝得到了越来越多的应用。自1990年代以来，Reneker19等人证明了静电纺丝技术将多种聚合物制备成纳米纤维的可行性。基于静电纺丝所得的独特的材料属性，静电纺丝在生物医学上的应用越来越多20。静电纺丝是一种价格便宜、操作简单的技术方法，其制备的纳米聚合物的纤维直径范围广泛，可从3 nm至5000 nm21。因与生物分子大小在一个尺寸，静电纺丝制备的纳米纤维适合模拟生物体内微环境。纳米材料如可包裹纳米颗粒的纳米纤维，其纤维形态以及其他复杂的结构形式能促进其与细胞的相互作用，例如，选择性内吞作用，细胞粘附

36、以及定向的迁移作用等22-24。此外，此种结构的比表面积(surface area to volume ratio, SVR)较大，为纳米纤维提供了较高的孔隙体积，从而能够促进生物活性分子的装载以及营养物质和废物的运输和交换。这些优良的特性使得静电纺丝所制得的纳米纤维成为一种重要的生物材料。本课题拟采用静电纺丝技术制备PLLA纳米纤维作为坐骨神经组织工程支架材料，使用速度可调(20-1000 rmp)的滚筒收集器，通过设置一定的转速、浓度、电压、钝性针头与接收器的距离，在一定范围内的空气湿度和温度下制备所需要纳米纤维支架。1.2.2 用于周围神经损伤修复中的种子细胞种子细胞是周围神经损伤修复的

37、研究中重要的因素之一。理想的种子细胞主要是指分裂增殖能力强、功能旺盛、无或仅有较微弱的免疫反应，能够在体内存活并融入组织，能够转染并表达外源基因，并且获取方法简单，采用非侵袭手段或者通过微创手术即可获得。目前临床上使用的种子细胞主要包括SCs、胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)、成体干细胞(somatic stem cells, SSCs)以及诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)等。SCs是周围神经微环境的重要组成成分，被认为是创造和维持损伤神经再生微环境中的重要因素，其细胞外基质和细胞粘附分子能够为轴突

38、的生长提供支持和引导作用。神经损伤后，SCs迅速发生从髓鞘化到支持生长模式的表型转换，并且能够进行巨噬细胞招募以吞噬坏死组织碎屑以及降解的轴突。在周围神经修复的过程中SCs能够分泌生长因子为神经细胞的生长提供营养25, 26，是周围神经损伤修复研究中最理想的种子细胞。然而由于其有限的细胞来源、较强的免疫排斥反应以及复杂的细胞分离纯化方法等问题，SCs在临床上的应用前景受到了极大的限制27。ESCs一般是人类早期囊胚的内细胞团在适当的体外培养条件下衍生出的未分化的细胞系。当条件适合时，ESCs能够分化成200多种细胞类型，几乎可分化为人体和动物的各种类型的体细胞28，理论上也是神经损伤修复中理想

39、的种子细胞来源。但是，目前利用ESCs分化为特定的神经细胞类型用于神经修复还具有一定的挑战性，而且目前建立的ESCs株均来自于体外受精过程中废弃的受精卵，引发较多伦理的问题。另外，尽管已有报道称将ESCs应用于体内髓鞘再生时，ESCs能够迁移并分化成中枢神经系统以及周围神经系统中的神经细胞以及神经胶质细胞，并且在对神经退行性疾病29，眼科退行性疾病30以及I型糖尿病31的治疗中ESCs也取得一定的成果，但临床上较有意义的治疗还未实现32，并且移植ESCs时发现其潜在在的致瘤性和免疫排斥问题阻碍了其在临床上的广泛使用31, 33。用于周围神经修复中的SSCs主要包括神经干细胞(neural stem cells, NSCs)、骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stem cell, BMSCs)