实时荧光定量PCR详细操作步骤(3页).doc

《实时荧光定量PCR详细操作步骤(3页).doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实时荧光定量PCR详细操作步骤(3页).doc（3页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、-实时荧光定量PCR详细操作步骤-第 3 页实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。反转录反应 反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。反转录反应条件如下。 37C 15 min（反转录反应） 85C 5 sec（反转录酶的失活反应） Real Time PCR反应 选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。基因引物序列扩增片段长度NR2BN

2、R2B(+)CCGCAGCACTATTGAGAACA213 bpNR2B()ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18s rRNA18s rRNA(+)TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA198 bp18s rRNA()CGTTTATGGTCGGAACTACGA1） 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。 试剂 使用量 终浓度 SYBR Premix Ex TaqTM（2） 12.5 l1 PCR Forward Primer（10 M） 1 l0.4 MPCR Reverse Primer（10 M） 1 l0.4 M模板（cDNA溶液） ldH2O 10 lTotal 25 l 全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF，4管做18S rRNA。4管BDNF或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 l。2）三步法PCR 首先95C 作用3 min。 PCR进行35个循环。步骤温度时间变性95C30 秒退火58C30 秒延伸72C30 秒融解曲线温度时间变温速度95C0秒20C/秒55C15秒20C/秒95C0秒0.1C/秒