药品GMP文件 无菌检查法.docx

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1、目的：建立无菌检查法的标准操作程序，规范无菌检查法的操作。范围：适用于无菌检查法。职责：检验室主任、检验员。规程：1概述无菌检查是检查药品、敷料、缝全线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其它的品种是 否染有活菌的一种方法，无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污 染，同时也应防止在有抑菌条件下操作。该检查法根据供试品有无抑菌作用而采用薄膜过滤法或直接接种法两种方式。2仪器、设备和用具2.1无菌室分无菌操作室和缓冲间，在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂 钩、拖鞋等物，无菌操作室外应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，局部洁净度100级或放 置同等级别的超净工作台，

2、室内温控（252）及除湿装置.，缓冲间及操作室内均设置能到达 空气消毒的紫外灯和照明灯，操作室或工作台应保持正压。2. 1. 1无菌室应每周和每次操作前用（） %新洁尔灭溶液或2%甲酚液或其他适宜消毒液擦 拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时，在每次操作完毕，同 样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。1.1 1.2无菌室的无菌程度检查，无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空 气中菌落数；取直径约90mm双碟，在接种室外内点燃乙醇灯，在乙耨灯旁，以无菌操作，将 双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml制成平板，在3035c预培养4

3、8小时，证明无菌 后将平板3个，以无菌方式带入无菌操作室内的洁净区左、中、右各放1个；翻开碟盖放置， 平板在空气中暴露30分钟后将碟盖盖好，置3035c培养48小时，取出检查，100级清洁度 要求：3个平板上生长的菌落数平均不得超过1个。无菌操作台面或超净工作台定期请有关部门检测其洁净度,应到达1000级（一般尘埃粒了计 数仪）检测尘埃粒径W5 um的粒数不得超过3. 5个/升；空气流量应控制在0. 751. 0m7S；细 菌菌数平均VI个，可根据无菌状况必要时置换过滤器。1.2 1. 3无菌室内应准备好盛有消毒用5%甲酚或其他适宜消毒溶液的玻璃缸、乙醇灯、火柴、 镜子、75%乙醇棉、碘酒棉及

4、拖鞋等。1.3 真空泵 极限压力6X10 2pa,抽数1L/S转速1400r/niin,功率0. 25KW,置于无菌室外，以耐压橡皮管通入无菌操作室，也可用封闭式过滤器代替抽气装置。1.4 恒温培养箱及可调2025c的生化培养箱。1.5 离心机，显微镜，蒸汽灭菌器，标准pH比色器（0.02%酚磺酬指示液和溪钾酚蓝指示液）， 恒温烤箱。1.6 玻璃器皿 试管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管（1、5、10小1刻注射器（2、5、10ml）、 双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。使用过后如与细菌接触，应先灭菌倒出内容 物后再清洗，晾干，凡无菌操作过程中所用的器皿，都应用牛皮纸包扎严密，121灭

5、菌30 分钟，或置于耐热容器中盖妥160干热灭菌2小时。1.7 5.1移液管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞少许棉花，然后放于吸管筒内或牛皮纸 袋内，盖严，灭菌备用。2 . 5.2试管，离心管，三角瓶等在管（瓶）1 1塞上海棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管 口内2/3处，用牛皮纸将管口（包括寨子）包扎严，灭菌备用。3 .5.3将注射器，针头（9号、11号、12号）配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、管和 针头分别放在双层纱布（或布）内，包扎严密，置带盖容器（瓷盘或铝制饭盒）内，盖严，用牛皮 纸包扎后，灭菌备用。2.6 无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，灭菌备用或用一次性的无

6、 菌物品代替。2.7 长柄取样匙，放下长的玻璃筒内（或不锈钢长筒内），盖严，干热灭菌备用。2.8 微孔滤膜宜径50mln,孔径0.45um,新购的一批滤膜，需进行孔径大小的测试，一般有 三种方法，选其中一种方法即可。气泡法 先将滤膜浸入水中，使完全湿润，然后用银子夹住一片滤膜入于气泡点测定装置 或滤膜孔径测定仪上，膜上放一块与滤膜大小相同的尼龙筛网。再加上多孔板，将螺旋固定圈 旋紧，在多孔板上加35mm深的水（注意排除气泡）关闭放气阀，启动空压机或氮气瓶阀，使 压力缓缓上升，注意观察水面上产生第一个气泡时，记录压力表的压力，气泡点压力不应小于 2. 2kg/cm2 （0. 2Mpa） o水流量

7、法 将滤膜装于除菌滤器上，开动真空泵，压力在700mmllg（93kpa）下，抽滤已滤清 的水约500ml，计算出每Imin的滤速，1995年版中国药典对滤膜的滤速未明确规定，而USP（X X HD规定在700mmHg（93kpa）压力下，滤膜直径47nlm,流速5575ml/min。细菌过滤法 常用的细菌为粘质沙雷氏菌（Serratia marcesens CMCC（B）41002）,将该菌的 新鲜营养琼脂斜面培养物，接种于营养肉汤培养基中，3035培养1820小时，用无菌0. 9% 氯化钠溶液稀释至10相当于7X105CFU/ml），取此菌液1ml,加至50ml无菌0. 9%氯化钠溶液 中

8、，按薄膜过滤法过滤，取该滤液5ml接种于营养肉汤培养基40ml中，3035培养24小时， 应无菌生长，不符合规定的滤膜不得使用。2.9 除菌滤器 目前有多种滤器；如STV2型无菌检查薄膜滤器装置，磁力除菌滤器及封闭 式滤器等，现就普遍应用的STV2型无菌检查薄膜器及封闭式滤器的准备分述如下：2.9.1 STV2型无菌检查薄膜滤器是由除菌过滤器和底座排液架两局部组成，新购置的滤 器，需用毛刷将该滤器的各部件用水刷净，除去垢物，用水冲洗45次，蒸伟水冲洗I次.玻 璃筒放于玻璃洗涤或清洁液中过液，再用水，蒸储水洗净，晾干。除菌滤器的装配。在滤器的漏斗部上面置1个橡胶圈，圈上加多孔垫板，在垫板上垫一个

9、四 氯乙烯薄膜垫圈，放上已浸湿的微孔滤膜1片，在其上垫一个四氯乙烯薄膜圈及橡胶圈，安装 玻璃筒，套上金属固定架，拧上底部螺母，漏斗底部套上橡皮塞。将己装配妥的滤器放入于带盖的瓷盒（或饭盒）中，盖严，外用牛皮纸包扎灭菌备用。底座排液架的排液管口接一耐压橡胶管，将管口用纱布，牛皮纸包扎灭菌备用.该架经灭菌 后放于无菌室内可反复使用。2. 9.2封闭式滤器 一般由电脑集菌仪和一次性使用集菌培养器组成。前者放于无菌操作 区台面上。3. 10手术镶、手术剪洗净、擦干，用双层纱布将1把剪与1个镜间隔包扎在一起，放于带 盖的容器（瓷盒或铝制饭盒）内，盖严，用牛皮纸包扎灭菌备用。4. 11抽滤瓶一般为1000

10、2000ml,用水及蒸储水洗净，晾干，瓶口用已配有两个玻璃管（一 个通至瓶底，一个短些）的橡皮塞盖紧，短的玻璃管上套一个短耐压橡胶管。抽气口用耐压橡 胶管与空气过滤玻璃器（内充填以棉花）相连，空气过滤玻璃器的另一管口用纱布，牛皮纸包扎 严紧，抽气瓶的全部装置用牛皮纸包扎，灭菌备用。2.12用具的灭菌将包扎当的用具（除另有规定外），在（121 土 0.5）C蒸气灭菌30分钟， 物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌，应 置恒温培养箱中烘干，适高温灭菌的器皿也可采用160c干热灭菌2小时。3试液5. 1 75%乙醇溶液配制酒精棉球用。5.2 碘酊溶配制碘酒棉

11、球用。5.3 无菌0.9%氯化钠溶液，分装于试管，三角瓶或玻璃瓶中，瓶中用棉塞，橡胶塞或海绵 胶专用塞塞紧并用牛皮纸包扎，灭菌备用。也可用氯化钠注射液。5.4 新洁尔灭（1： 1000）溶液。5.5 35%甲酚溶液或其他适宜消毒溶液。1.1 6 0. 02%酚磺酸指示液Ph6. 88. 4系列比色液管。1.7 澳甲酚蓝指示液pH6. 0-7. 6系列比色液管。1.8 2moi/L盐酸溶液。1.9 2moi/L氢氧化钠溶液。3. 1()无菌的青霉素酶溶液。4培养基3.1 一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的pH值应 符合规定，否那么必须校正后，灭菌使用。3.2 新

12、鲜配制的培养基，应按中国药典规定的处方，对培养基的原材料要进行挑选，化学 药品均需用CP试剂规格。3.2.1 除葡萄糖和指示液外，将处方中各成分加水后置有石棉网的电炉或适宜的加热设备 中，使微温溶解，用2moi/L氢氧化钠溶液调节pH,使其比规定的pH值略高0.40.6,煮沸, 用棉(纸)浆减压抽滤或以脱脂棉，滤纸等滤材过漉，使培养基澄清。3.2.2 加葡萄糖和指示液，摇匀，补足水量，调节pH值(比规定的pH值略高0.20.4), 使灭菌后为7. 1 0.2,分装，装量不宜超过容器的2/3,以免灭菌时溢出。3.3 培养基灵敏度检查新购的脱水培养基或采用不同品牌原材料的配制的新鲜培养基，其质量均

13、应符合灵敏度检查 要求。4. 3. 1 菌种(1)藤黄微球菌MicrocoCcus lutekus CMCC ( B ) 28001(2)生胞梭菌Clostridium sporogenes CMCC (B)64941 (3)白色念珠菌Candida albicans CMCC(F)98001 5. 3.2操作4. 3. 2. 1需气菌，厌气菌培养基用藤黄微球菌和生胞梭菌两种菌检查。取藤黄微球菌的营养琼脂斜面新鲜培养物，加无菌0.毁氯化钠溶液3ml,制成均匀的菌悬液, 再以无菌0.9%氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度，然后作1()倍系列稀释，制成 1ml中含10100个菌(CFU)并

14、计数。取生抱梭菌的需气菌厌气菌培养基的新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管内，离 心，弃去上清液，取沉淀菌体用无菌0.9%氯化钠溶液制成均匀菌悬液，吸取上述菌悬液，用无 菌0. 9与氯化钠溶液稀释，照上述方法制成1ml中含10-100个菌并计数。4. 3. 2. 2真菌培养基用白色念珠菌检查。取白色念珠菌的真菌琼脂斜面新鲜培养物，加无菌0.舞氯化钠溶液3ml,制成均匀的菌悬液, 照膝黄微球菌项下方法稀释制成1ml中含10100个菌并计数。5. 3. 2. 3取藤黄微球菌的营养肉汤，生狗梭菌的需气菌厌气菌培养基的新鲜培养物，白色 念珠菌的真菌培养基的新鲜培养物各1ml,用无菌0.9%氯化钠

15、溶液作10倍系列稀释，制成1ml 中含10100个菌并计数。6. 3. 2. 4将藤黄微球菌的上述之一的稀释液各iml,分别接种至每管装量说9ml的需气菌, 厌气菌培养基3管，生胞梭菌的上述之一的稀释液各1ml,分别接种至每管装量为12ml的需气 菌，厌气菌培养基3管，由白色念珠菌的上述之一的稀释液各1ml,接种至每管装量为9ml的 真菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天，并逐口记录结果。7. 3.3结果判断 以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度 检查符合要求。4.4 配制的培养基应保存在凉暗处，一般不得超过2周，临用前细菌各真菌培养基分别经 3

16、035c和2025c培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长后方可使用。4.5 需气菌，厌气菌培养基的指示剂氧化层不得超过培养基深度的1/5,否那么经水浴煮沸 10分钟，但只限加热一次，无菌试验培养时间结束时，指示剂氧化层应不超过培养基深度的 l/2o5对照用菌液的制备5.1试验用菌种，菌种的复苏，转种与保存等均应按照“抗生素微生物检定法”标准操作 规程项下操作。5. 2 金黄色葡曲球菌菌液，川接种环取金黄色前萄球菌StaphylocoCcus aureus CMCC(B)26003的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至需气菌，厌气菌培养基内，在3035 培养1618小时，用无菌0. 9%氯化

17、钠溶液稀释制成每1ml中含10-100个菌。5. 3生抱梭菌菌液 用接种环取生抱梭菌Clostridium sporogoncs CMCC(B)64941的 需气菌，厌气菌培养基新鲜培养物少许，接种至相同的培养基内，在3035培养1824小 时，用无菌0. 9%氯化钠溶液稀释制成每1ml中含10-100个菌。5.4 白色念珠菌菌液 用接种环取白色念珠菌anda albicans CMCC(F)98001 的真菌琼 脂培养基斜面培养物少许，接种至真菌培养基内在2025培养24小时，用无菌0.9%氯化钠 溶液衡释制成每1ml中含10-100个菌。5.5 上述制备的菌液，一般当日使用。6抑细菌和抑真

18、菌试验取每管装量为9ml需气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管,分别接种金黄色葡萄球菌、 生泡梭菌、白色念珠菌10100个菌各两管，其中1管加供试品规定量，按规定的温度培养3 5 H,如培养基各管24小时内微生物生长良好，那么供试品无抑菌作用，如加供试品的培养基管 与未加供试品的培养基管对照比拟，微生物生长微弱、缓慢或不生长，均判断为供试品有抑菌 作用。该供试品需用稀释法或中和法、薄膜过滤法处理，消除供试品抑菌性后，方可接种至培 养基。7检查法采用直接接种法和薄膜过游法。前者适用于非抗菌作用的供试品：后者适用于 有抗菌作用的或大容量的供试品。1.1 1供试品检验量和培养基用量照中国药典200

19、0年版无菌检查法项下表1,表2或表3规 定，备妥。除供试品外，培养基在移入缓冲间前应先编号，并用0.居新洁尔灭溶液或酒精棉擦 拭瓶（管）外壁，然后连同其他用具（包括无菌衣，帽，口罩等）移入缓冲间，开无菌间紫外灯和 空气过滤装置开关，并使其工作在1小时以上。1.2 操作前用肥皂水清洗双手，关闭紫外光灯，进入缓冲间，换拖鞋，再用碘酒棉，75% 乙醉棉球擦手，穿载衣、帽、口罩，将所需物品剥去牛皮纸，移入无菌间，每次试验中所在所 用物品必须计划好，并且有备用物。1.3 供试品外部消毒。7. 3. 1气雾剂，油剂等铝盖压封的橡皮塞小瓶先用75%乙醇棉球擦拭外壁及瓶塞，待干，用 灭菌镜子剔去铝盖上的铝质小

20、圆片，过火焰数次。7. 3. 2安甑:针剂先用碘酒棉球将安甑外部擦拭灭菌，待干，用砂轮或灭菌锂轻割安瓶颈部 （使于折开安瓶），再用75%乙醇棉球将碘酒擦净，待干。7. 3. 3其他从试品容器外表或外包装可参照上述用适当消毒液擦拭或浸没后以无菌的方式 取内容物。7.4直接接种法7.4. 1供试品制备用灭菌镜子取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，使供试品瓶盖和注射器针头 均应迅速通过火数次，当供试品为粉针剂，瓶盖为橡胶塞时，用注射器吸取规定的溶剂在已消 毒好的橡胶塞中心位置刺入小瓶加入溶剂，使溶解，混匀后吸出溶液。如为注射液，供角膜创 伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液等可直接用注射器吸取药液

21、。按规定或需灭活的供试品可用灭 活剂溶解，将瓶内供试液抽出稀释至规定的浓度。需加入空气加压后便于抽出的供试品，应用 注射器对着火焰抽取空气加入，抽取瓶中液体时，应将供试品倒置并使针头在液面下。供试品如为供直接分装成注射用无菌粉末的原料药（大包装粉针剂），取样时为缩短暴露时 间，应有两人操作。将经置缓冲间中用0.陶新洁尔灭溶液抹净外壁且经紫外线照射1小时的大 包装瓶移入操作间（台），除去铝盖，用75%乙醇棉擦拭瓶品橡胶塞外壁和瓶口缝隙，待干，戴 好医用消毒手套，在火焰旁小心揭开瓶塞，用灭菌长柄不锈钢药匙取出规定量的样品，置经 10（）天平称定重量的灭菌试管中，密塞待用，立即盖好大包装瓶塞，用橡皮

22、胶胶布及时封口， 再用封箱纸包扎瓶口。从上述待无菌检查用的样品试管中，以无菌操作称取一定重量，按各该药品项下的规定制成 溶液，依法接种于上述培养基中。供试品如为外科敷料，取经紫外线照射后的供试品4个包装，以无菌操作拆包装，于不同部 位分别剪取约100mg或lX3cm?的供试品11份，缝合线取最小包装5个，拆开包装，用灭菌蹑 子共取11股，接种足以浸没供试品的适量培养基中。供试品如为放射性药品，用适当灭菌用具取供度品1瓶（支），接种于装量为7. 5ml的培养基 中，每管接种0.2ml。7. 4.2操作，用适当灭菌用具，取上述制备妥的供试品在近火焰上以右手握拳，小指为主 拨开培养基管的塞子，管口通

23、过火焰，移至火焰下侧，沿着培养基管壁分别接种于需气菌，厌 气菌培养基6管（其中1管于操作结束后移至接种室接种金黄色葡萄球菌对照液1ml）,真菌培 养基5管。轻轻摇动使匀，需气菌、厌气菌培养在3035培养，真菌培养基在2025C培 养7日，培养期间应表逐日检查是否有菌生长（阳性对照在24小时内应有菌生长），并填写检 查记录表。如在加入从试品后，培养基出现浑浊，培养7日后，不能从外观上判断无微生物生 长，可取该培养液适量接种于同种新鲜培养基中或斜面上，继续培养，细菌培养2日，真菌培 养3FI,观察是否再现浑浊或斜面上有无菌落生长，在接种的同时，取培养液少量，涂片制成 染色标本，用显微镜观察是否有菌

24、生长。7.5薄膜过滤法 依照所用的薄膜滤器种类不同，操作方法各异，就目前普遍使用的有二， 一种为薄膜过滤系统，一种为封闭式过滤器，现分述于下：7. 5. 1过滤系统的安装如采用STV2型薄膜过滤器时，拧紧薄膜过滤器的金属底座螺母，将其固定在排液金属架上， 用耐压橡皮管将排液金属架的排液口与抽滤瓶塞中长的下班管相连，用螺旋夹拧紧瓶塞的另一 个排气管，并将抽滤瓶的空气过滤装置的下班管与某些人空泵相连，采用其他薄膜过滤系统时， 按其使用说明书进行操作。如采用封闭式过滤器时，将一次性集菌培养器（依供试品种类不同选择适宜的集菌培养器如抗生素类采用抗生素专用集菌培养器）放于电脑集菌仪的架匕而塑胶软导管放于

25、电脑集菌仪 的蠕动泵的管槽内，其进液导管的双芯针头，插入供度液或冲洗液等容器的塞上。操作7. 5. 2.1如供试品有抗菌作用，按中国药典2000年版无菌检查法1或表3规定量取供试品, 照直接接种法供试品制备项下，吸取供试液加入无菌（）.9%氯化钠溶液或其他适宜的溶液至少 100ml具塞的瓶中，混匀。采用薄膜过滤器时，通过火焰，将瓶塞翻开倒入薄膜滤器内，立即 开动真空泵将供试液抽干，然后用无菌0.9%氯化钠溶液或其他适宜的溶剂冲洗滤膜，每冲洗一 次需将液体抽干，冲洗次数及冲洗液量依供试品种类及量而异，至阳性对照菌正常生长为度， 翻开抽气瓶塞中的排气管的螺旋夹，将过滤器从排液管架取下，松动底座的螺

26、母，取下滤膜部 分，用灭菌镜将滤膜取出，放入灭菌双碟中，用灭菌剪刀将滤膜剪成3等份，分别加入需气菌, 厌气菌和真菌培养基中。采用封闭式过滤器时，将双芯针头插至供试液容器塞上，开动电脑需 动电脑蠕动泵电源，使药液均匀通过3个一组的集菌培养器，待药液排尽，关闭电源，将针壮 举取下插至无菌0.9%氯化钠溶液或其他适宜的冲洗液的容器塞上，冲洗集菌培养器的滤膜，照 上术操作要求，冲洗次数及量以阳性对照细菌生长为度.关闭电源，将集菌培养器上排气孔胶 帽取卜，套于集菌培养器底部的排液管口上，将连接集菌培养器塑胶管之一用夹子（或止血钳） 夹紧，将针头插入含需气菌，厌气菌培养基200ml的容器塞上，启动电源，使

27、该种培养基均匀 加至两个集菌培养器中，分别用夹子夹运费与其相连的两个塑胶管，同时开通另一个塑胶管的 夹子，将针头插入含真菌培养基lOOnil的容器塞上，启动电源，待真菌培养在全部移入培养器 中，关闭电源，取下集菌培养器，用夹子夹紧塑胶管近闻，用剪切断塑胶管远端。7. 5. 2. 2将已操作完毕的培养基移出，依从试品特性加入相衣的对照菌液1ml （抗细菌药 物，以金黄色例萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生抱梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色 念珠菌为对照菌），按规定温度与时间培养.阳性对照管细菌应在培养2448小时，真菌应培 养2472小时有菌生长。大容量非抗菌作用的供试品，薄膜过滤后，无须冲洗。

28、7. 5. 2. 3每次操作时，均应取相应溶剂和稀释剂，及冲洗液同法操作，作为阴性对照。8结果判断当阳性对照管为浑浊并确有细菌生长时，可根据观察所得的结果判定，如需气菌，厌气菌及 霉菌培养管均为澄清或虽、显浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌，厌 气菌用霉培养管中任何1管显浑浊并确证主有菌生长，应重新取样，分别依法复试2次，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否那么应判为供试品不合格。无菌检查记录表检品编号室温湿度检品名称规格生产单位包装有效期供样单位检品数量验讫数量批号收检日期检验目的检验日期检验依据报告日期供试液制备：1常规法 供试品瓶（支） 无菌0.9%氯化钠溶液ml2非水溶性供试品 从试品 瓶（支）加乳化剂（g或ml）检查法 1直接接种法2薄膜过滤法药液浓度冲洗液用量nil培养时间1234567备注1需气菌、厌气菌2培养基3451真菌培养基234阳性对照阴性对照结论:本品按中国药典2000年版附录IX - 11无菌检查法检验，结果符合规定。检验者校对者: