【实验报告】血液凝固及其影响因素(5页).doc

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1、-【实验报告】血液凝固及其影响因素-第 5 页实验五：血液凝固及其影响因素 实验人： 同组人： 【实验目的】1 学习血液凝固的基本过程2 了解加速或延缓血液凝固的一些因素【实验原理】血液凝固是一个酶的有限水解激活过程，在此过程中有多种凝血因子参与。根据凝血过程起动时激活因子来源不同，可将血液凝固分为内源性激活途径和外源性激活途径。内源性激活途径是指参与血液凝固的所有凝血因子在血浆中，外源性激活途径是指受损的组织中的组织因子进入血管后，与血管内的凝血因子共同作用而启动的激活过程。【实验材料和用具】家兔清洁小试管7个、小烧杯2个、竹签、秒表、试管架、哺乳动物手术器械一套、兔手术台、动脉夹、塑料动脉

2、插管、线、棉花、水浴槽、冰盒液状石蜡、肝素、草酸钾12mg、脑匀浆液0.1ml、生理盐水【实验过程】1、 动物麻醉及颈部手术 （此部由助教老师操作）取一只动物，称重。按1g/kg体重的剂量将乌拉坦（氨基甲酸乙酯）由耳缘静脉缓慢注入，观察动物肌张力、呼吸与角膜反射的变化。动物麻醉后背位固定于兔手术台上。剪去颈部手术野的毛，沿颈正中线在喉头上一指至锁骨上一指的地方作一57cm的皮肤切口。分离皮下组织及肌肉。2、 颈总动脉插管（此部由助教老师操作）在气管两侧辨别并分离颈总动脉，颈总动脉下方穿两条线备用。在左侧颈总动脉的近心端夹一动脉夹，在动脉夹远心端距动脉夹约3cm处结扎。用小剪刀在结扎线的近侧（结

3、扎线与动脉夹之间）沿向心方向剪一小斜口（约占管径的一半），向心脏方向插入动脉插管，由备用的线结扎固定。取血时将动脉夹松开即可。3、 血液凝固的加速和延缓观察1. 打开兔颈总动脉夹，血液从动脉插管流出，弃去第一份1mL动脉血后，向每个试管中注入1mL兔动脉血，并摇匀。2. 自血液流出动脉插管开始计时。除第1管外，其他各管每隔15秒钟将试管倾斜一次，观察液面是否倾斜即血液是否流动，直到试管内血液不再流动为止，记录凝血时间。3. 当第2管已经凝固时，再倾斜第1管看血液是否凝固，若尚未凝固则按上述方法每隔15秒钟倾斜一次，直到血液凝固为止，记录凝血时间，即为该兔血的凝固时间。4. 以第2管为对照，各管

4、观察其他各管中血液凝固时间。5. 向第9管中滴加2氯化钙2滴，观察血液是否凝固。6. 取出第5管中的玻棒，用水洗净，观察附着在玻棒上的纤维蛋白。注意事项：a) 取放试管时要用拇指和食指捏住试管的上端，不要握住试管的底部，以免手的温度影响结果。b) 每支试管口径及采血量要尽量一致，不可相差太大。c) 记录凝血时间要准确。d) 判断凝血的标准要前后一致。一般以倾斜试管达45时，试管内血液不见流动为准。【实验结果及相关讨论】管号实验条件凝血时间（一组）凝血时间（二组）现象解释1加入0.1肝素溶液0.1mL（6滴）大于20min大于20min肝素是抗凝剂，能不可逆的阻止血液凝固。由于肝素钠具有带强负电

5、荷的理化特性，能干扰血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝血作用。其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶（AT-）结合，而增强后者对活化的a、a、a、a和a凝血因子的抑制作用。其后果涉及阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。中和组织凝血活素（因子）。抑制血小板的聚集和释放。它对血中有机成分和无机成分的测定均无影响。2加入2草酸钾溶液0.1mL （6滴）大于20min血液凝固的多个环节中都需要钙离子的参与，故通常用枸橼酸钠、草酸钠和草酸钾作为体外抗凝剂，它们可与钙离子结合而除去血浆中的钙离子，从而起到抗凝作用。理论上当继续向

6、血液中加入CaCl2溶液，CaCl2中的钙离子会起到凝血因子IV的作用，从而使再次启动凝血过程，血液凝固。草酸盐是可逆性抗凝剂。但本次实验中加入CaCl2后并没有出现凝血现象，可能是CaCl2溶液配置有问题，或者由于操作不当，凝血因子已经完全失活。3室温（6滴生理盐水）静置7min30s7min30s血液流出血管后，很快会凝固。血液流出血管后血小板4室温（6滴生理盐水）每隔15S倾斜454min5min倾斜可加速血小板的粘附聚集过程，并加大血小板释放的凝血因子与血细胞的接触面积，从而加快了凝血的过程。该过程是内源性凝血过程。5细玻璃粉少许（6滴生理盐水）2min45s3min玻璃粉是异物，可激

7、活凝血因子及血小板，启动凝血过程。6脑组织浸出液（6滴）15s30s脑组织液中有组织因子途径抑制物，是外源性凝血途径的特异性抑制剂，因而能加速凝血过程。7置于40水浴（6滴生理盐水）165s165s适当升高温度，能增加酶的活性，加快凝血过程。8置于10水浴（6滴生理盐水）大于20min降低温度可以降低酶的活性，延缓凝血过程。9竹签搅拌（6滴生理盐水）有富有弹性的纤维蛋白纠缠在竹签上同上 在竹签的搅动下，特别是缠上线的接触面粗糙的竹签，能加速凝血过程，使凝血因子按一定顺序相继激活而生成凝血酶，最终使纤维蛋白原变为纤维蛋白，而纠结在竹签上，形成一层蛋白膜。机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间

8、的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键。机体的正常止凝血，主要依赖于完整的血管壁结构和功能，有效的血小板质量和数量，正常的血浆凝血因子活性。其中，血小板和凝血因子是生理性止凝血的重要成分,(见图1)。抗凝系统不仅包括抗凝因子，还包括纤溶系统。BT出血时间CFT束臂试验CRT血块收缩试验BPC血小板计数CT凝血时间 RT复钙时间 APTT活化部分凝血活酶时间PT凝血酶原时间PF3血小板第3因子TF组织因子Fb纤维蛋白TXA2血栓素A2 5-HT5羟色胺PK激肽释放酶原HMWK高分子量激肽原图1 正常止血机制及血栓与止血常用筛选试验检测环节血小板的作用：在正常的血液循环中，血

9、小板并不与内皮细胞表面或其他细胞发生作用，而是沿着毛细血管内壁排列，维持其完整性，血管局部受损伤时，血小板的止血兼有机械性的堵塞伤口和生物化学性粘附聚集作用。止血时，首先是受损的血管壁发生收缩，使局部血液流动变慢或减少。血液中的血小板在vWF因子存在下迅速粘附于暴露的胶原纤维，此时血小板被激活，血小板形态发生改变，由正常的圆盘状态变为圆球形，伪足突起，血小板发生聚集(血小板膜糖蛋白IIb/IIIa由纤维蛋白原介导发生互相粘附、聚集)，此为血小板第一相聚集，激活的血小板便发生释放反应和花生四烯酸代谢，其中许多物质，如血小板的ADP等，可加速血小板的聚集、变性成为不可逆的“第二相聚集”，形成白色血

10、栓，构成了初期止血的屏障。与此同时，由血小释放和激活许多促凝物质参与血液凝固反应。血小板膜磷脂表面提供了凝血反应的场所，血小板第3因子在凝血过程多个环节中发挥重要作用，血小板合成释放的TXA2和5-HT促使进一步收缩，血小板收缩蛋白则最终可使纤维蛋白收缩(血块收缩)，使血栓更为坚固，止血更加彻底。凝血过程：血液凝固简称凝血，是血液由流动状态变为凝胶状态的过程，它是止血功能的重要组成部分。凝血过程是一系列凝血因子被相继酶解激活的过程，最终生成凝血酶，形成纤维蛋白凝块。迄今为止，参与凝血的因子共有14个。其中用罗马数字编号的有12个(从，其中因子并不存在)。习惯上，前4个凝血因子常分别称为纤维蛋白

11、原(因子)、凝血酶(因子)、组织因子(因子)和钙离子(因子)。凝血因子VI已知是血清中活化的凝血因子V，故不再视为一独立的凝血因子。1内源性凝血途径内源性凝血途径是指参加的凝血因子全部来自血液(内源性)。临床上常以活化部分凝血活酶时间(APTT)来反映体内内源性凝血途径的状况。内源性凝血途径是指从因子激活，到因子X激活的过程。当血管壁发生损伤，内皮下组织暴露，带负电荷的内皮下胶原纤维与凝血因子接触，因子即与之结合，在HK和PK的参与下被活化为a。在不依赖钙离子的条件下，因子a将因子激活。在钙离子的存在下，活化的a又激活了因子。单独的a激活因子X的效力相当低，它要与a结合形成1：1的复合物，又称

12、为因子X酶复合物。这一反应还必须有Ca2+和PL共同参与。2外源性凝血途径外源性凝血途径：是指参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。这一过程是从组织因子暴露于血液而启动，到因子被激活的过程。临床上以凝血酶原时间测定来反映外源性凝血途径的状况。组织因子是存在于多种细胞质膜中的一种特异性跨膜蛋白。当组织损伤后，释放该因子，在钙离子的参与下，它与因子一起形成1：1复合物。一般认为，单独的因子或组织因子均无促凝活性。但因子与组织因子结合会很快被活化的因子激活为a，从而形成a组织因子复合物，后者比a单独激活因子增强16000倍。外源性凝血所需的时间短，反应迅速。外源性凝血途径主

13、要受组织因子途径抑制物(TFPI)调节。TFPI是存在于正常人血浆及血小板和血管内皮细胞中的一种糖蛋白。它通过与因子a或因子a-组织因子-因子a结合形成复合物来抑制因子a或因子a-组织因子的活性。另外，研究表明，内源凝血和外源凝血途径可以相互活化。3凝血的共同途径从因子X被激活至纤维蛋白形成，是内源、外源凝血的共同凝血途径。主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。(1) 凝血酶的生成：即因子a、因子a在钙离子和磷脂膜的存在下组成凝血酶原复合物，即凝血活酶，将凝血酶原转变为凝血酶。(2) 纤维蛋白形成：纤维蛋白原被凝血酶酶解为纤维蛋白单体，并交联形成稳定的纤维蛋白凝块，这一过程可分为三个阶段，

14、纤维蛋白单体的生成，纤维蛋白单体的聚合，纤维蛋白的交联。纤维蛋白原含有三对多肽链，其中纤维蛋白肽A(FPA)和B(FPB)带较多负电荷，凝血酶将带负电荷多的纤维蛋白肽A和肽B水解后除去，转变成纤维蛋白单体。从纤维蛋白分子中释放出的FPA和FPB可以反映凝血酶的活化程度，因此FPA和FPB的浓度测定也可用于临床高凝状态的预测。纤维蛋白单体生成后，即以非共价键结合，形成能溶于尿素或氯醋酸中的纤维蛋白多聚体，又称为可溶性纤维蛋白。纤维蛋白生成后，可促使凝血酶对因子的激活，在a 与钙离子的参与下，相邻的纤维蛋白发生快速共价交联，形成不溶的稳定的纤维蛋白凝块。纤维蛋白与凝血酶有高亲和力，因此纤维蛋白生成

15、后即能吸附凝血酶，这样不仅有助于局部血凝块的形成，而且可以避免凝血酶向循环中扩散。在凝血共同途径中有两步重要的正反馈反应，有效地放大了内外源凝血途径的作用。一是Xa形成后，可反馈激活因子、；二是凝血酶形成后，可反馈激活因子、以及凝血酶原。凝血酶还可促使血小板发生聚集和释放反应，刺激血小板收缩蛋白引起血块退缩。但大量凝血的产生却反过来破坏因子、和因子，这是正常凝血的负反馈调节，以防止不适当的过度凝血。抗凝剂的选择：（1） 草酸钾：常用于尿素、肌酐、纤维蛋白原等测定，不能用钾、钙等测定，对LDH、丙酮酸激酶、AKP和淀粉酶有抑制作用。（2） 肝素：常用于电解质、血气分析、血氨等测定。抗凝剂比例为5

16、061u肝素/5ml血。注意钠盐可使淀粉酶升高。（3） 氟化钠：常用氟化钠草酸钠混合抗凝剂作血糖测定的抗凝剂，氟化钠可以抑止烯醇化酶，它可避免血细胞葡萄糖酵解酶的作用，延长标本的保存时间。（4） 二乙胺四乙酸钠盐（EDTA-Na2）：生化常用的抗凝剂，但不能用于钙、钠、及含氮物质的测定，对淀粉酶、肌酸激酶、AKP、ALP、5-核苷酸酶等可抑制，对丙酮酸激酶有明显升高的作用。（5） 枸橼酸钠，测定血沉用3.8%枸橼酸钠抗凝，抗凝剂与血液比例为1：4，凝血试验需用3.2%枸橼酸钠抗凝，比例为1：9。（6） 实验室使用抗凝剂种类较多，血细胞分析及红细胞比积测定宜用EDTAK2抗凝，保证室温下6小时RBC体积不变，抗凝剂比例为1.02.0mg/1ml血。【参考文献】生理学 姚泰 人民卫生出版社动物生理学实验 魏香 清华大学出版社