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1、-文献综述-第 20 页文献综述随着现代人民生活水平的不断提高,人们对猪肉的需求已从对猪肉的需求量的增长转移到猪肉品质和风味的提高。实践证明，过去集中在猪遗传改良的育种计划取得了很大的成功，诸如，生长速度，胴体瘦肉率都有了较大的遗传进展，然而，这种高强度的选择却带来了猪肉品质与风味的下降等负面影响。当人们越来越重视猪肉风味的趋势下，在养猪生产中获得量多优质的猪肉成为育种工作者面临的重要任务。猪肉品质可定义为与鲜肉或加工肉的外观和适口性有关的一些特性，包括猪肉的色质、硬度、肌肉系水力、大理石纹（肌内脂肪含量）等。研究表明：猪肉的肉质性状属多基因控制的数量性状，有一系列主基因或数量性状位点决定。分

2、子生物学迅速发展，大大促进了利用相关的分子标记技术对控制与猪胴体和肌肉品质相关的数量性状座位QTLs的定位或主基因的研究，并在实践中较好的推动了猪肉品质改良的育种进程。在猪的胴体及肉品质方面，一些候选基因的分离功能及其基因效应已得到明确，并被初步应用于育种实践。但许多在生理、生化过程与猪肉品质相关的候选基因对相应数量位点（QTLs）的相关联程度或基因贡献大小都有待进一步研究确认，以便更好地应用到标记辅助选择（MAS）中去。骨骼肌的生长速度是决定猪肉产量的主要因素,而肌内脂肪的相对含量亦是影响猪肉品质关键因素之一。脂肪和肌肉相关基因控制的性状在宏观上表现为生长、胴体和肌肉品质相关的性状。因此,对

3、于猪肌肉生长和肌肉品质的分子遗传机制的研究主要围绕骨骼肌生长、胴体和肌肉品质相关性状而进行。近年来,对控制猪肌肉生长、脂肪沉积基因的研究一直是国内外学术界十分活跃的研究领域,特别是与猪肉品质有关的基因更是近几年来的研究热点。研究成果最显著的是两个近乎质量性状基因的肉质控制座位,即氟烷基因( Hal) 和酸肉基因( RN) 。生长激素(growth hormone , GH) 基因和类胰岛素生长因子( IGF2 ) 基因由于在生长轴中调控地位的重要性而曾被当作肌肉生长性状的候选基因57 。心脏脂肪酸结合蛋白基因(heart fatty acid bindingprotein , H2FABP)

4、和脂肪组织脂肪酸结合蛋白基因(adipocyte fatty acid binding protein ,A2FABP) 作为肌内脂肪含量(intramuscular fat content , IMF) 的候选标记已引起了国内外学者的关注,并有部分肯定性的研究结果811 。此外,te Pa s 等(1999) 认为肌细胞生成素基因(myogenin ,MYOG) 和初生重、生长速度及瘦肉率相关12 。钙蛋白酶抑制蛋白基因(calpa statin , CAST) 和抑肌素基因(myo statin gene ,MSTN) 是肌肉生长的重要候选基因之一13 。与脂肪酸代谢有关酶类、结合蛋白基因

5、是背膘厚和瘦肉率的重要候选基因,如激素敏感脂肪酶基因( hor2mone sensitive lipa se , HSL ) 、肥胖基因( obe se ,OB) 等。肌肉脂肪的种类和含量极大地影响猪肉的感官性状。例如，日粮中共轭亚油酸（不饱和脂肪酸）含量不同会改变胴体品质，增加亚油酸（不饱和脂肪酸）会降低脂肪沉积，提高瘦肉率(ostrowska et al.1999)，然而，在日粮添加亚油酸（不饱和脂肪酸）能提高乙酰CoA，羧化酶，苹果酸酶，6-磷酸-葡萄糖-脱氢酶等几种脂肪合成酶的活性(Mourot et al.1994)。最近，影响皮下脂肪组织亚油酸含量的的QTL 作图于 Iberian

6、 Landrace 杂交猪的4号染色体上脂肪酸的分类：自然界的脂肪酸可以分为三类，饱和脂肪酸(Saturated Fatty Acid. SFA)，如软脂酸、硬脂酸等；单不饱和脂(Monounsaturated Fatty Acid, MFA)，如油酸等；多不饱和脂肪酸 （Polyunsaturated Fatty Acid, PUFA），如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸(ARA)等。动物体内能够合成饱和与单不饱和脂肪酸（称为非必需脂肪酸）；但不能合成维持机体正常生长和健康所需的一些脂肪酸(称为必需脂肪酸，EFA )，如亚油酸和亚麻酸等，它们只能从食物中获得，其中亚油酸在甘油三酯和磷酸脂中占脂肪酸

7、总量10%-20%。脂肪酸的结构特点： 脂肪酸常用缩写符号表示，即第一个数字表示酞基链的碳原子数，紧跟着是一个冒号，以后的一个数字表示不饱和和双键数，然后是一个n- (或)，其后的数字表示从酞基链的甲基端数起第一个双键的碳原子位置。 n-3脂肪酸的第一个双键位于甲基端第三个碳原子上，n-6脂肪酸的第一个双键位于甲基端的第六个碳原子上(图1), 饱和脂肪酸棕搁酸16: 0单不饱和脂肪酸(油酸18, In-9)n-3多不饱和脂肪酸(亚麻酸18:3n-3)n-6多不饱和脂肪酸亚油酸18:2n-6图1.饱和脂肪酸，n-9单不饱和以及n-6和n-3多不饱和脂肪酸结构示意图Figure 1 Sketch

8、map of saturated, n- 9 monounsaturated, n- 6 and n 3 polyunsaturated fatty acid脂肪酸在生物体内的主要作用：脂肪酸是生物体基本组成之一，具有重要的生理作用。它们既是细胞膜脂的主要成分，又是重要的能源物质，还是一些信号分子的前体。可与其它物质一起，分布于机体表面，防止机械损伤和热量散发等。此外它还与细胞识别、种特异性和组织免疫等有密切关系。多不饱和脂肪酸的消化吸收：PUFA在动物体内消化吸收过程同其他脂类类似。日粮脂类呈乳悬液状，以三酸甘油酷和磷脂形式进入十二指肠。在肠内，脂-水临界面胆汁盐类使其吸附共脂酶(colip

9、ase),随之受到各种消化酶胰酶、脂酶、醋酶和磷脂酶的作用。最后大多数以极低密度脂蛋白(VLDL)输送。多不饱和脂肪酸的合成与转化：哺乳类动物细胞可以由乙酰CoA从头合成饱和的以及n-9和n-7不饱和脂肪酸，其他的PUFA的生物合成是在饱和脂肪酸合成途径上扩展的，由两个主要反应组成，即碳链的延长和脱氢。多不饱和脂肪酸的代谢：脂肪酸-氧化( KKnoop（1904）循环：脂肪酸-氧化是体内脂肪酸分解的主要途径，脂肪酸氧化可以供应机体所需要的大量能量，脂肪酸-氧化也是脂肪酸的改造过程，人体所需要的脂肪酸链的长短不同，通过-氧化可将长链脂肪酸改造成长度适宜的脂肪酸，供机体代谢所需。每一轮脂肪酸氧化都

10、是由4步反应组成：氧化、水化、再氧化和硫解。EPKennedy 和 ALLehninger（1949）指出此氧化系统存在于线粒体中，后来DEGreen及FLynen（1953）各自独立地从线粒体的丙酮粉末提取出可溶性酶，成功地分离出氧化各个阶段的酶，明确了脂肪氧化如图所示，按下述过程进行。（1）由脂肪酸活化酶使脂肪酸与 CoA结合，（2）由乙酰CoA脱氢酶的作用使乙酰CoA脱氢，（3）由烯酰CoA水合酶的作用使烯酰CoA加水，（4）由-羟基乙酰 CoA脱氢酶的作用使-羟基乙酰 CoA脱氢，（5）由-酮酰CoA硫解酶的作用使酮酰CoA裂解。经以上五个阶段逐次游离出来的乙 酰CoA（C2片段）经三

11、羧酸循环而氧化。不饱和脂肪酸的氧化除需上述各种酶之外，还需要催化3-顺-烯酰CoA转变成2-反式的3-顺， 2-反-烯酰CoA异构酶和催化D（一）-3-羟式成L（ ）-3-羟式的3-羟乙酰CoA3-表异构酶参与。由奇数C原子脂肪酸分解产生的丙酰coA，通过羧化及异构化而转变成琥珀酰CoA再进一步变化。不饱和脂肪酸的氧化。不饱和脂肪酸也在线粒体中进行-氧化，所不同的是饱和脂肪素-氧化过程中产生的脂肪烯酰coa是反式2脂烯酰coa，而天然不饱和脂肪酸中的双键均为顺式。因此，需经线粒体特异的3顺2反脂烯酰coa异构酶的催化，将3顺式转变为-氧化酶系所需的2反式构型，然后沿-氧化途径进行代谢。过氧化酶

12、体脂肪酸氧化，除线粒体外，过氧化酶体中亦存在脂肪酸-氧化酶系，它能使极长链脂肪酸氧化成较短链脂肪酸，而对较短链脂肪酸无效；在脂肪酸氧化酶（fad为辅基）催化下，脱下的氢不与呼吸链偶联产生atp而是生成h2o2，后者为过氧化氢酶分解；丙酸的氧化，人体含有极少量奇数碳原子脂肪酸，-氧化后除生成乙酰coa外，最终生成丙酰coa。另外，支链氨基酸氧化亦可产生丙酰coa。丙酰coa经-羧化及异构酶的作用可转变为琥珀酰coa，然后参加三羧酸循环而被氧化。饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸都是通过-氧化途径降解的，然而，不饱和脂肪酸在进入-氧化作用循环前还存在双键，而与-氧化直接有关的酶不可能处理所有的不同双链结构和

13、天然化合物，故其代谢还需要额外的具有特殊功能的酶。多不饱和脂肪酸进入-氧化有两种途径来获得饱和（如图2）：一种是由参与-氧化的酶和3, 2-酰基-CoA 异构酶来完成氧化；另一种是NADP依赖的2,4-dienoyl-CoA脱氢酶(EC .34)和3, 2-酰基-CoA 异构酶(EC 5.3.3.8).结合作用而获得饱和，最终完成氧化。靠-氧化的脂肪酸代谢主要发生在线立体内，还有少部分在过氧化物酶体中进行。大多数生物学来源的天然不饱和脂肪酸包括-cis双链和额外的双键，在三个碳原子间发生反应是非结合性的。这样的分子结构对于-氧化循环来说是有疑问的，在哺乳动物中三种辅酶必须有适合于氧化的稳定结构

14、。第一种辅酶是enoyl-CoA异构酶，其催化的产物能够进行下一步完整的-氧化循环，接下来的初始步骤是产生一个2,4-dienoyl-CoA。对于enoyl-CoA水合酶来说，这属于一个稀有底物，此时另外一种辅酶2,4-dienoyl-CoA还原酶（DECR）开始作用，DECR有显著的底物特异性，能够加工处理不论立体结构如何的所有偶数不饱和脂肪酸和大多数的奇数不饱和脂肪酸。DECR在线立体和过氧化物酶体中有活性，线立体还原酶（mDECR）的存在确保CoA的含量不至于降低到所有细胞器氧化功能严重削弱的水平，而过氧化物酶体DECR对长链底物作用比mDECR更具有活性，当然，过氧化物酶-氧化的功能是

15、将长链脂肪酸改变为mDECR易于处理的形式。在这三种辅酶中，DECR可能是限速酶，另外两种酶的Vmax从几百到1000mol/min/mg不等，而mDECR的Vmax是30mol/min/mg，因此，DECR可能是不饱和脂肪酸氧化的控制点。对于人类生存来说，这与酶活性的重要性相一致，因为DECR的缺乏是致死性的。已知有两种结构完全不同的DECR，两种酶都可以利用NADPH来催化2,4-dienoyl-CoA还原为enoyl-CoA，在细菌中发现有一种典型的埃希氏大肠杆菌单体酶，包括辅基FMN，FAD，和一个4Fe-4S群的三个主要结构域。催化产生一个trans-2-enoyl-CoA直接进入-

16、氧化循环。哺乳动物的DECR，其产生一个trans-3-enoyl-CoA。接着第三个辅酶dienoyl-CoA异构酶催化trans-3-enoyl-CoA的衍生物形成更加稳定而且适合于-氧化的结构trans-2-enoyl-CoA。trans-2,cis/trans-4-dienoyl-CoA+NADPH+H+ Trans-3-enoyl-CoA+NADP+。哺乳动物和埃希氏大肠杆菌具有非常相似的底物特异性，但有不同的分子性质，牛肝脏和大肠杆菌的DECR的亚基的分子质量分别是32，000和73，000Da，天然酶蛋白的分子量分别为124，000和7，000Da，所以，哺乳动物的2,4-die

17、noyl-CoA还原是由四个同型亚基组成的四聚体，而大肠杆菌是一个单体酶。真核生物DECR属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）超家族成员，在已清楚的酶中有15%-30%相同序列的酶有3000多种，家族成员展示了一个调节不同生物学过程的特定底物的巨大扩展。SDE家族成员的晶体结构已有7个基元图形描绘，这对于酶蛋白结构，辅助因子（NADH或NADHPH）的识别，结合，定位以及催化作用都是重要的。人类mDECR含有5种与结构稳定和辅助因子结合的方面有关这类基元，但缺乏发生在催化部位的两种基元。虽然与SDE家族其他成员相似，但与其他enoyl-thiolester 还原酶是截然不同，因为它催化与众不同的共

18、轭二烯增加物（an unusual addition onto a conjugated diene），而其他酶一般涉及脂肪酸的延伸，在延伸过程中增加一个2，3（或，）双键。Fillgrove 和 Anderson运用一种精细的一流的生化核磁共振对大鼠肝脏mDECR的研究鉴别了还原的立体化学过程是新颖的并且在催化反应中一个赖氨酸是基本的。在经典的SDRs中，这个赖氨酸在活性部位YXXXK基元与酪氨酸结合（X是任意氨基酸），而酰基还原酶的活性基元是YXXMXXK。在mDECR的氨基酸序列中，离基本氨基酸赖氨酸N-末端最近的酪氨酸有大约14个氨基酸残基，一般情况下，一个丝氨酸直接和接触反应的酪氨酸

19、结合，但对mDECR的序列分析并不能揭示这个氨基酸为侯选氨基酸。寻找结构信息去鉴别普遍存在的酪氨酸-丝氨酸对或确切地识别是否不同侯选型贡献DECR的功能。 人类DECR基因编码335个氨基酸多肽。但很可能认为成熟的酶通过线立体的靶序列去除来截短的。我们已描绘了缺乏N-末端34个残基的人类mDECR重组体的去除顶端的特性，它不仅有活性而且提供高度规则的晶体结构。分子替换计算是不成功的，而这种相位首先从硒代甲硫酸氨的衍生物中获得。后来，我们获得了一个三元复合物并结合定点突变和动力学分析测定残基对酶活性大小贡献大小。现在，我们详细描述该酶的结构、辅助因子决定性和底物识别、关键残基的鉴定和他们对mDE

20、CR功能的贡献。 上的NADP和trans-2,trans-4-dienoyl-CoA。一个同型四聚体是一个带有特定接触反应催化中心的短链脱氢酶/还原酶；二元复合物与三元复合物在结构上高多相似，这表明此酶在与底物结合、加工过程中存在巨大的构象变化，催化位点是开放的且位于一个能够容纳和加工广范围的脂肪酸柔性环附近。DECR的同型四聚体结构主要在肝脏、心脏、胰脏、和肾脏中表达。此酶的缺乏可导致一个致死综合征，患者的症状主要表现为低纤维蛋白和高赖氨酸血症，尿液和血液中存在2-trans-4-cis-decadienoylcamitine，此代谢物的存在是亚油酸的不完全氧化所致。DECR1基因的研究进

21、展 DECR1基因编码2.4-dienoyl-CoA还原酶（EC.34）。该酶参与机体内多不饱和脂酰基CoA的 -氧化，对机体的新陈代谢有着重要的作用。人的DECR基因位于8号染色体的91,082,756 - 91,133,403 （Ensembl Transcript ID： ENST00000220764），有10个外显子和9个内含子，总长度为30kb，转录长度为1,251 bps，翻译产物335个氨基酸残基。alignment score黑猩猩的DECR基因位于8号染色体15,844,203 - 15,872,473（Ensembl Transcript ID：ENSPTRT000000

22、37769or ENSPTRT00000037770），有5个外显子和4个内含子，转录长度为545 bps，翻译产物147氨基酸残基。alignment score小鼠的DECR基因位于4号染色体15,844,203 - 15,872,473（Ensembl Transcript ID：ENSMUST00000029877），有10个外显子和9个内含子，转录长度为2,962 bps，翻译产物335氨基酸残基。alignment score负鼠的DECR基因位于 scaffold_3 的 76,987,553-77,034,082（Ensembl Transcript ID：ENSMODT000

23、00009676or ENSMODG00000007644），有9个外显子和8个内含子，转录长度为942 bps，翻译产物313氨基酸残基。alignment score牛的DECR基因位于14号染色体的45,837,768-45,860,253，有10个外显子和9个内含子，转录长度为963 bps ，翻译产物320 哥氨基酸残基；alignment score狗的DECR基因位于29号染色体的38,517,112 - 38,544,277（ENSCAFT00000014318），有9个外显子和8个内含子，转录长度为948 bps， 翻译产物为315 氨基酸残基；alignment score

24、斑马鱼的DECR基因位于16号染色体的42,359,361 - 42,370,930 （Ensembl Transcript ID ：ENSDART00000025292），有10个外显子核9个内含子，转录长度为1,487 bps，翻译产物为氨基酸残基325；alignment score猪的DECR1（2,4-dienoyl-CoA reductase 1）基因位于4号染色体上，近来，一个对在皮下脂肪组织中亚油酸含量有极大影响的QTL被定位于Iberian Landrace 杂种猪( 2000).的4号染色体上。Iberian猪的等位基因与亚油酸含量有1.5%的相关性并且此QTL表明在这两个

25、商品猪种的表型有25%的差异。此QTL与对脂肪沉积起主要作用的the FAT1 QTL (A) 染色体定位的一致性可提示在此区域的侯选基因（包脂质代谢）的特性。猪的DECR基因位于4号染色体上靠近着丝粒的SW1003微卫星, 微卫星S0001 和SW839之间。有趣的是，DECR基因在染色体上的位置与影响背膘中亚油酸含量的QTL可靠区域非常一致。然而，DECR基因位于的the FATI QTL区间可能包含一个多效基因和几个脂质代谢和脂肪降解的主效基因。PCR-SSCP 分析技术 单核苷酸多态性标记（Single Nucleotide Polymorphism, SNPs）被称为“第三代DNA遗

26、传标记”。其是生物体基因组中存在的最广泛的一类变异，包括由碱基置换突变、单个碱基的缺失或插入等单碱基突变所造成的位点多态性。SNPs的突变频率低，这样SNPs在构建完整的遗传图谱中成为一类十分有用的遗传标记。例如，在人类的基因组中，对于一个杂合度为30的SNPs，其发生的频率平均为1/1.3kb。有许多不同的方法可用于SNPs分析，SSCP分析技术是其中的一种。SSCP的建立与发展 日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体构象主要是有其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，有一个碱基发生变化时，会或多或少地影响其空间构象，是构象发生改变，空间构象有差异的单链DN

27、A分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中受排阻大小不同。因此称该方法为单链构象多态性（Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP）分析。刚建立时是首先将基因组DNA用限制性内切酶消化，碱变性成单链后经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，在经Southern转移到尼龙膜上，最后用标记探针杂交和放射自显影检测单链DNA片段的迁移。在随后的研究中，Orita等又将SSCP用于检测PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高检测突变方法的简便性和灵敏性。随着研究的深入改用银染法对电泳后的非变性聚丙烯酰胺凝胶染色，从而建立了非放射性检测方法。为了进一步提

28、高SSCP检测率，可将SSCP分析与其他突变检测方法相结合：其中与杂交双链分析（Heterocluplex analysis,Het）法结合可以大大提高检测率。Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳被分离开。PCR-SSCP方法的原理 经PCR扩增的DNA片段在变性剂或低离子浓度下，经高温处理使之解链并保持在单链状态下，在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链可折叠成一定的空间构象，相同长度DNA单链因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，单链DNA构象的变化很可能引起了迁

29、移率的改变，通过显色或显影在凝胶上显示出带型的差异，即多态性，这就说明检测到了突变。PCR-SSCP能够检测出任何类型的突变，包括单碱基替换。这种单碱基替换突变可以出现在几百个核苷酸长的目标序列中的任何位置。PCR-SSCP的特点 1989年问世的PCR-SSCP作为检测基因突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快捷、灵敏、不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要，适于大样本筛选，因而具有一定的推广价值。但它也有不足之处：例如，他不能指出碱基突变的位置，只能作为一种突变检测的手段，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；所检测的片段不能太大，否则检测率低；电泳条件要求较严格；由于SSCP是

30、依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。尽管如此，该方法和其他方法相比仍有较高的检测率。首先，他可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Hayashi经试验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，99可被SSCP发现，对于300450bp片段的灵敏度为89，因此，他认为现在知道的所有单碱基突变大多数可用该方法检测出来。另外，PCR-SSCP不仅灵敏地检测出非编码序列中的突变，且能准确、有效地筛选出类保守座位中的突变，这位检

31、测某个全长基因的多态性提供了有效的方法。PCR-SSCP方法应用 PCR-SSCP技术建立以来，不断的发展、完善，再连锁分析和基因作图等领域取得了很大的成效。同时被广泛应用于检测引起各种遗传病的基因突变，如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤型基因、家族性结肠息肉基因的研究中。此外，可检测肿瘤组织中的癌基因或抑癌基因的体细胞突变以及多态性，例如检测星型细胞瘤、肠癌等肿瘤中的p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等。再者，其可用于病毒的分型、监测PCR试验中的污染情况，以及病原体传播途径的研究中。近年来，PCR-SSCP技术应用于家畜DNA多态性研究的报道也日益增多。单学松应用SSCP

32、方法对奶牛weaver基因突变进行了检测，并探讨了影响SSCP检出率的因素。Larsen等对PCR扩增的pGH基因614bp片段进行了SSCP分析，并报道了其研究成果。方美英等应用PCR-SSCP分析发现了猪氟烷基因的多态性。姜运良等对猪雌激素受体基因和猪肌肉生长抑制素基因进行了PCR-SSCP检测，在所检测的序列中均存在单链构象多态性。Maddox用PCR-SSCP方法检测了绵羊DMB、DYA和DYB基因的第二外显子，分别发现了2、3和4个等位基因。从以上可以看出，SSCP正在分子生物学领域发挥着巨大的作用。目前，国内外还没有关于猪DECR基因的文献报道，作者意图用PCR-SSCP方法检测猪

33、DECR基因。本研究的目的与意义目前，更多的研究集中于多不饱和脂肪酸的合成上，尤其是脂肪酸脱氢酶的结构和功能以及相关基因的研究。但对于多不饱和脂肪酸在生物体内的分解代谢研究较少，本文就多不饱和脂肪酸氧化分解途径中的关键限速酶2,4-dienoyl-CoA还原酶的基因结构作部分研究。-氧化，其催化的反应为：trans-2,cis/trans-4-dienoyl-CoA+NADPH+H+ Trans-3-enoyl-CoA+NADP+。在该反应中，若不饱和脂肪酸以底物的形式参与-氧化，该酶不仅可形成2，4-二烯酰CoA复合物，而且可降低NADPH/ NADP+比率。基于DECR1酶在不饱和脂肪酸代

34、谢中的重要作用，其表达量或者活性的定额变化可能影响脂肪酸的组成，尤其是亚油酸的含量，最终影响猪肉品质 鉴于该线粒体酶在多不饱和脂酰基CoA（PUFA）-氧化过程中的重要作用，很明显我们需要在分子水平上更多更详细地研究这个基因。目前仅有芬兰 、意大利 、西班牙等少数国家对猪的该基因进行过研究，中国大陆尚未有这方面的报道。本研究对猪基因组DNA的制备条件及DECR1基因exon2的PCR扩增反应条件的优化进行研究。希望能为今后更深层次的研究该基因积累经验和一些分子水平的资料，也为深入研究猪DECR1基因的结构奠定基础。1材料与方法1材料与方法实验材料 实验猪来源及采样方法实验用耳组织样品均采自山西

35、大同市种猪场，实验猪群体来源名称及样品数量见表1。耳组织样的采集：在不影响猪耳号的地方，用耳号钳剪耳组织一小块（大约）放于装有lml 70乙醇的的离心管中，带回实验室，-70 保存备用。表1 实验猪群体的来源名称及样品数量来源群体样品数量（头）山西大同市种猪场长白山西大同市种猪场杜洛克山西大同市种猪场山西白猪山西大同市种猪场马身猪 仪器和试剂.1主要仪器（1）基因扩增仪：PTC200，美国MJ Research（2）超纯净水系统：英国Elga（3）凝胶成像系统：美国UVP（4）微型台式冷冻离心机：Z233MK-2德国HERMLE（5）全自动高压灭菌器：日本三洋（6）制冰机：SIM-F124，日

36、本三洋（7）台式高速冷冻离心机：TGL-16G-A ，上海安亭科学仪器厂（8）三恒多用电泳仪：DYY-12B，北京六一仪器厂（9）恒温水浴摇床：SBD50，丹麦Heto（10）酸度计：上海雷磁（11）电子天平：FA1604，上海天平仪器厂（12）超低温冰箱：丹麦Heto（13）磁力搅拌器：95-1，上海安亭仪器厂（14）旋涡混合器：QL-901，江苏海门麒麟医用仪器厂（15）电热恒温水浴箱：北京医疗设备厂（16）l 10l 200ml 1000ml（17）Wp700L17型微波炉：中国顺德.2工具酶及主要试剂（1） 十二烷基硫酸钠（SDS）：北京鼎国生物技术有限责任公司（2） Tris饱和酚：

37、天津灏洋生物制品科技有限责任公司（3） dNTPs：TIANGEN BIOTECH（BEIJING）CO.，LTD.（4） 琼脂糖（Agarose）：北京鼎国生物技术有限责任公司（5） 蛋白酶K（Proteinase）：（6） TaqDNA Polymerase：北京天为时代科技有限公司（7） 50bpDNA Lander ：北京天为时代科技有限公司（8） Rnase：北京鼎国生物技术有限责任公司（9） 无水乙醇（Ethanol）：天津市大茂化学试剂厂（10） 其他常规试剂来自山西农大动物生化实验室1.1.3 溶液的配制溶液的配制主要参考由卢圣栋编写的现代分子生物学实验技术（第二版）6， 配制

38、溶液所用的水如无特殊说明,均用灭菌超纯水.（1）1M Tris.Cl(pH 8.0):称Tris.base ，加400ml水分装后高压灭菌。（2） EDTA（）：称二钠溶于400ml水中，用NaOH调 pH值至，加水定容至500ml，高压灭菌。（3）20SDS（）：在80ml水中溶解20g电泳级SDS，加热至68助溶，用HCl调pH至，加水定容至100ml。（4）3M NaAc（）：无水乙酸钠溶于60ml水中，用冰乙酸调至P定容至100ml，高压灭菌。（5）5M NaCl：在800ml水中加入 NaCl，加水定容至1000ml，分装后高压灭菌。（6）4M NaOH：称16克NaOH 溶于90m

39、l水中，然后定容至100ml。（7）STE溶液（耳组织DNA提取液）：，10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA（），高压灭菌。（8）Rnase A（10mg/ml）：将胰RNA酶溶于10mmol/L Tris.Cll(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份，-20保存。（9）蛋白酶K（20mol/ml）：在装有100mg蛋白酶K的瓶子内加入5ml超纯水，混均至溶解，分装成小份，保存于-20。（10）（10mol/ml）溴化乙锭：在10ml水中加入100mg的溴化乙锭，溶解后分装

40、于1ml小份，棕色瓶4保存。（11）6电泳上样缓冲液：溴酚蓝，二甲苯青FF，30的甘油水溶液，棕色瓶4保存。（12）TE；10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA（），用贮存液配制，高压灭菌，4保存。（13）5TBE：54g Tris碱，硼酸，20ml EDTA（），加水定容至1000ml。（14）氯仿：异戊醇（24；1，体积比）：取384ml氯仿，16ml异戊醇混合，棕色瓶保存。（15）70乙醇：取无水乙醇70ml，超纯水30ml，混匀，棕色瓶保存。实验方法 猪耳组织DNA的提取（1） 取耳组织一块（约10mg），放入的离心管中，用眼科剪剪碎。（2） 加入6

41、00l的STE，10l的蛋白酶K（20mg/ml）,15l的SDS（20）充分混匀。（3） 55水浴消化过夜，观察结果，除毛发以外的耳组织全部被消化。（4） 向各离心管加入等体积的Trise饱和酚（600l），轻摇均匀10min。（5） 4，12000rpm，离心10min。（6） 取上清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）轻摇10min。（7） 4，12000rpm，离心10min。（8） 取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）600l，混匀10min。（9） 4，12000rpm，离心10min。（10） 取上清液，加入2倍体积的冰乙醇(约1ml)，再加入体积的3M N

42、aAc(约60l)，水平摇匀，可以见到棉絮状的DNA样品出现。（11） 将DNA样品置于-70冷冻30min。取出，4 12000rpm 离心10min。DNA沉淀于离心管底部。（12） 用70的乙醇洗涤DNA沉淀2次，到掉乙醇，自然干燥后，加入200l TE溶解，再加5lRnase。 提取基因组DNA的电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测：取5l待检DNA溶液和1EB），电泳，150V电泳30min左右，凝胶成像系统下观察电泳结果，并拍照。同时，用紫外分光光度计测其浓度：DNA浓度（g/ ml）=OD260/280L稀释倍数 （L：比色标厚度）根据测得DNA的浓度，将其稀释到约50ng/ l，于4冰箱

43、保存备用。123 猪DECR1基因PCR扩增1 引物设计与合成由于GenBank中 ，没有猪的DECR1基因的全序列，用DNAMAN软件比较猪的DECR1基因mRNA与人的DECRI基因全序列有较高的同源性，所以根据GenBank发表的人的DECR1基因全序列，利用引物设计软件以及OLIGO 6.0 设计特异性引物，记为引物P1。 引物设计参考文献7，由北京奥科科技有限责任公司合成。所用引物序列如表表 所用引物的序列Table Sequences of primers used引物编号 引物所在位置 片段大小 引物序列No. position size(bp) primer sequence

44、M2 Exon2.2 PCR引物溶液的配制 PCR引物溶液的配制严格按照说明书进行。新合成的引物为固体粉末状，配制时首先12000转离心10min,再慢慢打开管盖，加足量的灭菌超纯水后盖上管盖，在漩涡混合器上充分振荡510min，灭菌超纯水的加入量按下面公式计算：V=（OD33）/(CMW)其中,V是需要加入的灭菌超纯水的体积，单位为l，OD为合成引物的OD数。MW为所合成引物的分子量，C为配制引物的浓度，一般配成100pM的贮存液，使用时稀释成10pM。.3 PCR条件优化 对PCR影响较大的因素有：退火温度、镁离子浓度和模板DNA的质量等。判断PCR扩增成功与否，主要看PCR产物是否为特异

45、性条带，PCR扩增的特异性主要取决于引物与模板的结合的特异性。而优化PCR反应的目的就在于找到可使扩增效率最高的退火温度和镁离子的浓度，增强引物与模板结合的特异性，并在保证扩增效率的前提下尽量降低PCR反应体系中其他成分的用量。因此，在对每一对引物进行扩增时，首先对其退火温度设一系列梯度进行筛选，可设计不同的镁离子浓度梯度，进行PCR扩增，然后选择特异性强，扩增效率高的浓度为最佳浓度。随后在此基础上对引物设一系列梯度进行PCR反应，以确定PCR反应体系的最优组合。猪DECR基因PCR反应体系组成及扩增程序间表表 猪DECR基因PCR反应体系优化结果Table The optional PCR

46、composition of pig DECR gene Name of primerTaq polymerase(l)10buffer（with Mg2）( l)dNTPs()( l)Primer(10pM) ( l)DNA(50ng/ l) ( l)ddH2O ( l)P1P2P3表 猪DECR基因最优化扩增程序Table The optimized PCR amplification programs of pig DECR gene引物名称Name of primer扩增程序PCR amplify programsP195，5min；95，30s；6130s；72，30s；31cycl

47、es；72，5minP2P31.2.4 PCR产物检测1 琼脂糖凝胶电泳（1）称取适量的g/ ml，即制成一定浓度的琼脂糖凝胶。（2）选择适当的梳子和电泳槽，按需制成适当的厚度的凝胶。（3）待凝胶凝固后，放入电泳槽，加入0.5TBE电泳缓冲液，至少高于胶面。（4）将待检测的DNA样品和加样缓冲液以6：1的比例混合均匀，加入点样孔，根据电泳槽的长度和时间确定适当电压。（5）凝胶成像系统检测PCR电泳结果拍照。2 PCR产物胶回收用UNIO-10柱式较胶回收试剂盒纯化。回收前先将3倍体积的无水乙醇加入washing solution瓶中充分混匀备用。（1） 将准备回收的PCR产物和上样缓冲液按6：1的比例混合，点样于回收孔中，50V电泳11.5h，使目的片段与其他条带尽可能分开。（2） 电泳结束后，在紫外灯下用手术刀片从琼脂糖