DNA重组技术的基本工具(讲课).ppt

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1、选修3,你还记得我们吗？,氢键 磷酸二酯键 DNA聚合酶 限制性内切酶 DNA连接酶 运载体,专题1.基因工程的基本内容,基因工程的概念,1.1 基因工程的基本工具,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程的发展史,1.3 基因工程的应用,1.4 蛋白质工程的崛起,基因工程的概念：,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。,别名： 操作环境： 原理： 操作水平： 结果：,基因工程是指按照人们的

2、愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因重组,DNA分子水平,定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。,基因工程的产物,这就要用到定向改造生物的新技术 基因工程,基因工程的概念,基因工程的发展史,（自学了解）,普通棉花 抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫基因),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接 导入,棉花细胞(含抗虫基因)

3、,转基因棉花植株,上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀” 限制性核酸内切酶,“分子缝合针” DNA连接酶,“分子运输车” 运载体,1、简称： 2、分布：,一、限制性核酸内切酶 “分子手术刀”,主要在原核生物中,限制酶,寻根问底(P4),你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之

4、失效，从而达到保护自身的目的。,限制酶在原核生物中的作用,思考与探究 P7,2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列 如：GAA TTC CCC GGG CTT AAG GGG CCC,限制酶所识别的序列有什么特点,（专一性）,限制酶的识别特点,3、特点:,识别特定核苷酸列, 切割特定切点,（专一性）,

5、4.切点：,磷酸二酯键,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,中心轴线两侧切开,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,Sma,平末端平末端,中心轴线处切开,4、结果：,产生黏性未端和平末端,以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称重复排列 如：GAA TTC CCC GGG CTT AAG GGG CCC,限制酶所识别的序列有什么特点,3、特点:,4、结果：,1、简称： 2、分布：,一、限制性核酸内切酶,主要在原核生物中,限制酶,识别特定核苷酸列, 切割特定切点,（专一性）,产生黏性未端或平末端,要想获得某

6、个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,Go back,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,EcoR,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,不同来源的DNA片段混合,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,酶切,1、作用:,把DNA片段拼接成

7、新的DNA，,2、作用原理：,催化磷酸二酯键形成,（不是氢键）,二、 DNA连接酶 “分子缝合针”,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4DNA连接酶,3、类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和 平末端,寻根问底 (P6),DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,作用 对象,DNA复制,基因重租,4、 DNA连接酶与DNA聚合酶比较,3、类型,E,coli,DNA,连接

8、酶,来源：大肠杆菌,作用特点：只连接黏性末端,T,4,DNA,连接酶,来源：,T,4,噬菌体,作用特点：连接黏性末端和平末端,2、作用原理：,催化磷酸二酯键形成,1、作用: ：,二、 DNA连接酶,把DNA片段拼接成新的DNA，,1、载体必须具备的条件： 能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； 具有一至多个限制酶切点，以便与 外源基因连接 具有某些标记基因，便于进行筛选。 对受体细胞无害,三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车”,2、常用的载体： 质粒， 噬菌体的衍生物， 动植物病毒等,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因,3、质粒,本质：小型环状DNA分子。,分布：许多细

9、菌、 酵母菌等生物,三、运载体,1、质粒： 2、需要的条件： 有1多个限制酶切点 能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的 染色体DNA上复制 有某些标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 对受体细胞无害 3、常用运载体： 质粒、噬菌体的衍生物或某些动植物病毒,1、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同种限制酶 B. 两种限制酶 同种连接酶 D. 两种连接酶,反馈练习：,2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,4、下列说法正确的是：（ ） A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列

10、 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、重组技术所用的工具酶是限制酶、 连接酶、运载体 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因 进行大量复制的过程可称为“克隆”,审题,2和7能连接形成ACGT TGCA； 4和8能连接形成GAATTC CTTAAG； 3和6能连接形成GCGC CGCG； 1和5能连接形成CTGCAG GACGTC。,教材P7思考与探究 1,1.1944年艾弗里(O.Avery)等进行了肺炎双球菌体外转化实验,证明了DNA是生物的遗传物质,并且证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,成为基因工程的先导,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,20世纪中叶，基础

11、理论取得了重大突破,2.1953年沃森和克里克建立了双螺旋结构模型,使生物学进入分子水平。,1958年梅塞尔松和斯塔尔,以大肠杆菌为实验材料,运用同位素示踪技术,用实验证明了DNA的复制是以半保留方式进行的.,1957年克里克提出中心法则的确立,3.1963年尼伦伯格和马太做蛋白质体外合成实验,破译编码氨基酸的遗传密码.,1)基因转移载体的发现 2)工具酶的发现 3)DNA合成和测序技术的发明,技术发明命使基因工程的实施成为可能,1967年罗思和赫林斯基发现细菌质粒有自我复制能力,为基因转移找到一种运载工具.,1970年阿尔伯(W.Arber)、内森斯(D,Nathans)、史密斯(H.C.S

12、mith)细菌中发现了第一个限制酶,1977年科学家又发明了DNA序列分析方法,1965年桑格发明了氨基酸序列分析技术,4) DNA体外重组的实现,1972年伯格(P.Berg)首先在体外进行了DNA改造的研究,成功地构建了第一个人工体外重组DNA分子.,1973年博耶和科恩使重组DNA转入大肠杆菌中,转录出相应的mRNA,并使外源基因可以在原核细胞中成功表达,至此表明基因工程正式问世.,1973年科学家才将质粒作为基因的载体使用,这是基因工程发展史上第一个成功的基因克隆实验,1973年科恩第一个建成“基因工程菌”，并创立基因工程模式,1973年称这“基因工程元年”，,科恩被称为基因工程发展史上的创始人,科恩并向美国申报了世界上第一个基因工程的专利技术,5)重组DNA表达实验的成功,1980年第一个转基因小鼠问世,1982年采用显微注射技术培养目出”超级小鼠”,1983年培育出第一例转基因烟草,1988年穆里斯发明了PCR技术,使基因工程技术得到了进一步的发展和完善.获1993年诺贝尔化学奖,1993年中国农业科学院的科学成功之路地培育出抗棉铃虫的转基因抗虫棉,6)第一例转基因动物问世,7)PCR技术的发明,