氯化钙法制备感受态(3页).doc

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1、-一、二、三、四、 氯化钙法制备感受态-第 3 页五、 我制氯化钙法感受态的步骤：1) 取大肠杆菌单菌落接种于2 ml LB液体培养基中，37 200 rpm过夜培养；2) 取0.5 ml菌液接种于50 ml LB液体培养基中，37 200 rpm培养2.5 h （OD600nm介于）；3) 菌液倒入冰浴预冷的50 ml离心管中，冰浴20 min，随后利用台式冷冻离心机在4 以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置1 min；4) 50 ml离心管中加入30 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，冰浴30 min，4 以410

2、0 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置片刻；5) 离心管中加入2 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，以滴管分装，滴加2滴（约100 l）于每个1.5 ml EP管中，冰浴放置，以备马上使用，余下加入甘油，使甘油终浓度约15%，同上分装于1.5 ml EP管中，-20 冻存（-80冰箱存更好，但咱舍不得总去开它），冻存感受态可在一周内使用（转化效率将随保存时间延长而有所下降）。需要注意的是：氯化钙经常是水合物，你得看清楚你用的氯化钙水合物的分子量，然后再换算。氯化钙溶液是过滤除菌的，使用液用前需要预冷。另外，要是总弄不好也可以买商

3、业化的感受态，不贵。热激法转化大肠杆菌1) 将质粒5 l （这个不固定，根据你质粒浓度调整即可）加入到新制的感受态中，轻柔旋转EP管以混合，置冰浴30 min；2) 随后静置于42 水浴90 s，之后迅速置于冰中2 min；3) 加入895 l（凑个1ml的总体积，其实多点少点没啥的） LB液体培养基，37 水浴45 min（摇床也行，但是转速要在50rpm内，太快了容易让质粒丢失）；4) 将水浴后的转化菌液取200 l滴加于含抗生素的LB琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；6) 余下菌液以4100 rpm离心2 min，倾倒上清，以残留的培养基（200 l）混悬细菌，滴加于上述琼脂板，并用涂布棒涂布

4、均匀；7) 待菌液被完全吸收后，倒置培养皿，并放于37 温箱过夜培养至菌落长到合适大小。二、制电击感受态的步骤（摘自cDNA文库组标准流程，大肠杆菌我很少用电转，主要是连接产物懒得纯化）：1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37，220rpm，培养14-16个小时。3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到时，停止培养。4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4，2500rp

5、m离心10分钟。5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4，4000rpm离心10分钟。6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4，离心10min。7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4, 4000rpm, 离心10min。8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于的离心管中，-80 冰箱中保存。同时取100 l感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。9.次日观察转化子生长情况，并记录。感受态成功的关键在于：1，试剂要冷，一直在冰上操作2，吹细胞动作要轻柔3，菌活力要足，一定要选对数期的菌进行4，每次转化完成后用质粒验证BL21是表达菌，直接转入质粒，灵敏度应该很高的