中国极地微生物的研究进展.ppt

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1、中国极地微生物的研究进展,苑孟,中国极地微生物学考察研究简史,从1981年起,中国微生物学家即涉足南极,并于1987年发表了第一篇论文(Nichuzhiet al.,1987),即The hetertrophic microbes in dry Victoria land and Ross Island Antarctica； 1984年之前,中国学者曾参与南大洋水体的细菌和生物量考察,并发表过数篇论文； 从1984年起,中国开始独立组队进行南极考察,中国海洋微生物学家参加了相关的考察活动； 上世纪末,我们进行了中国首次北极考察,微生物研究涉足北极地区(50年代吴宝铃先生曾随前苏联学者赴北极作

2、过考察),并发表过论文； 中国南北极微生物考察研究的成果为掌握极地微生物的基本状况,及研究全球变化对该特定生态环境系统的影响奠定了初步基础；本世纪初,中国学者又开始关注世界第三极青藏高原的微生物及其环境状况。,（一）类别 目前中国所取得的南极微生物主要类别见表2。,中国极地微生物调查研究主要成果,由该表可见,研究的微生物以细菌为主,次为菌物(即真菌)。 不完全统计表明所研究的细菌大约有38属(种),丝状菌物6属,酵母8属(种),此外尚有肠系细菌。不同功能类型的微生物包括固氮细菌、硝化细菌、石油烃降解菌、耐重金属菌、耐LPS菌、耐酸菌及卫生状况指示菌等等。 南极微生物的优势菌群：、-变性细菌群，

3、噬纤维菌-黄杆菌-拟杆菌群（CFB group）。,（二）极地生态环境与环境微生物学的研究 这方面的研究主要将微生物置于整个生态系统中分析,如南极磷虾集群过程、集群区及磷虾本身的微生物学研究，,在潮间带生态系统、食物链中的作用,菲尔德斯半岛及附近区域生态系统中微生物的多样性、生态结构特征、食物链及与生物/非生物因子间关系分析(吴宝铃等,1998)。,（三）极地微生物的开发利用研究,1、抗冻物质 冷适应微生物最显著的特征便是具有相对低的代谢速率，在长期的生物进化过程中形成了一系列的适应低温的机制。这些机制包括营养物质的吸收和转运、DNA的复制合成、蛋白质的合成、合成代谢和分解代谢的正常进行、能量

4、代谢的正常进行、细胞的分裂等。,2、多不饱和脂肪酸(Poly Unsaturated Fatty Acids，PUFA) 具有广泛而重要的生物功能，这已经被越来越多的人所认识。然而随着PUFA开发应用领域的扩大，来自于植物、哺乳动物和海洋鱼的PUFA远远不能满足市场需求，微生物特别是藻类、真菌能合成几乎所有的PUFA并能在工业规模上培育而被视为有开发价值的可替代的生物资源。在南极细菌中具有多聚不饱和脂肪酸 (PUEA)生成能力的细菌所占比例高于其在温带海洋细菌中的比例。,3、抗紫外辐射物质 在南极上空的臭氧层最薄时厚度仅为平时的50%，并出现了臭氧空洞，从而使UV一B总辐照度的比例增加uv一B

5、对藻类伤害的主要目标是藻细胞中分子中的蛋白质、色素、DNA等，抑制光合作用、生长发育，甚至导致细胞死亡。为了避免或减少UV辐射，生活在高辐射环境下的生物体形成了许多物理的或者化学的保护机制。Scytonemin 、MAAs是两类抗辐射的物质，如果提取这种化合物、了解其吸收紫外线的机理，有望将其作为防止紫外线的保护剂应用到化妆品中。类胡萝卜素在保护细胞和生物体免受光、气体和感光色素等损伤中起重要作用。,4、低温酶 低温酶的低温催化能力，低热稳定性使其在工业应用上有以下的优势:通过温和的热处理使低温酶失活，快速而经济地终止反应;生产过程在低温或室温下进行，无需加热和冷却，可以降低成本;生产过程便于

6、监控。,5、抗菌、抗肿瘤活性物质 据统计，人们己经从微生物中发现了8000多种具有抗菌和抗肿瘤活性的天然产物。然而，从陆生微生物中新发现的生物活性物质的种类正在减少，并且大部分是己知的化合物。 另一方面，越来越多的传染性病菌对传统抗生素逐渐产生了抗药性，威胁人类健康的三大疾病之一的癌症也难以找到有效的治疗药物，从而迫使生物学家寻找新的天然生物活性物质来解决目前面临的问题。因此，极地微生物由于具有独特的生理机制而成为最有希望为人类提供产生具有生物活性的新化合物的微生物资源宝库之一,传统的环境微生物生态学研究方法采用计数、微生物培养及鉴定，生理生化分析等手段进行，这些方法在很大程度上依赖于微生物的

7、培养和纯种分离技术。 纯培养很难，尤其是在南北极这样的极端环境中。现有研究认为在自然界中仅有0.001%一1%的微生物能够用现有的技术手段进行人工培养。而且经过平板培养微生物有机体还有可能会偏离原来自然种群的生理习性，甚至有可能偏离它们原来的基因型组合。 随着各种分子生物学技术的应用，使我们不必培养微生物，而直接通过对环境中的遗传物质的研究来达到目的，也为从分子水平上开展较为全面的、无偏差的微生物生态学研究开辟了新的途径。,极端环境微生物分子研究方法及进展,（一）从自然样品中直接提取核酸： 从环境样品中提取核酸的方法可分为两类，一是转移后裂解法，即先将微生物菌体与土壤颗粒分开，再提取DNA。另

8、一类是直接裂解法，即在土壤中直接裂解微生物菌体后提取DNA。相比之下，直接裂解法可以提取出沉积物样品中近乎所有的微生物种群，且DNA产量大。在高效裂解细胞的同时对己释放出的DNA不予破坏是提高DNA产出率的决定因素。目前己报道的裂解法有碾磨法、超声波裂解法、液氮冻融法、变性剂热裂解法、酶解法等。,需要提取DNA的方法,（二）分子生物学分析,1.DNA熔解(解链)及复性分析 该方法可应用于微生物群落结构的分析。通过测定整个群落的碱基组成和DNA的复杂性可估计出总的群落遗传结构及其复杂性。 分析DNA的熔解曲线可以得到碱基组成的于G+C%。在限定条件下，测定溶液中剪切的或热失活DNA的复性动力学可

9、以测定DNA序列的复杂性。 2.质粒指纹图谱分析: 质粒的大小和数目随物种的不同有所差异。质粒数是相对稳定的,它可用来区分同一物种的不同菌株。 3.低分子量RNA分布图 这种方法为tRNA(75-90%个核苷酸)和 5SrRNA(105-120个核苷酸)的双相电泳分离。,4.结合PCR的一些技术： 克隆文库分析法 限制性片段长度多态性分析(RFLP) 末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP) 变性梯度凝胶电泳(DGGE)或者温度梯度凝胶电泳(TGGE) 单链构象多态性分析(SSCP) 随机引物扩增多态性分析(RAPD) 将两种以上的上述的分子生物学方法结合运用。,克隆文库分析法 主要步骤包

10、括： (1)样品中总DNA的提取； (2)建立16S rRNA基因克隆文库； (3)以限制性内切酶进行酶切筛选文库； (4)测序； (5)序列的比较分析。,变性梯度凝胶电泳(DGGE)或者温度梯度凝胶电泳(TGGE) 在含有连续变性剂梯度或者连续温度梯度的凝胶中，加入双链的 PCR 产物，根据 PCR 扩增产物中不同 G+C 含量的 DNA 组分在凝胶中的移动速度的不同，直接反映 DNA 的多态性 。低 G+C 含量的组分在凝胶中变性较快，在凝胶中的移动速度较慢，高 G+C 含量的 DNA 在凝胶中变性较慢，在凝胶中的移动速度快，从而使不同 DNA 在凝胶中的位置不同，产生不同的带。该项技术已

11、经广泛应用于微生物生态学研究中，包括微生物群落多样性研究、环境变化对微生物群落影响的研究比较不同微环境微生物群落差异等。,南极中山站沉积物中微生物多样性分析及宏基因组文库研究 1.南极沉积物中微生物群落结构调查： DNA的提取纯化、PCR扩增、DGGE、序列测定和系统计划关系分析。 2.南极中山站排污入海口沉积物中微生物宏基因组文库的构建和研究： 沉积物中总DNA的提取、大片段目的DNA的筛选和回收、插入DNA片段末端补平、连接、体外包装。cosmid宏基因组文库的保存和阳性克隆的筛选、宏基因组文库评估、宏基因组文库中抗菌活性物质筛选、宏基因组文库中抗肿瘤活性物质的筛选、宏基因组文库中酶活筛选

12、。,北极深海沉积物中细菌多样性研究 对溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法等5种方法提取北极深海沉积物宏基因组DNA进行了比较; 并对沉积物宏基因组中16SrDNA基因PCR扩增相关的引物序列、引物浓度、退火温度和模板稀释度等条件，以及PCR产物的变性梯度凝胶电泳 (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)的聚丙烯酞胺凝胶浓度、变性剂浓度梯度进行了优化。,1.溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法1mL TENP缓冲液(50mMTris，pH8.0

13、，20mMEDTA， 100mMNaCl，0.01g/mLPVP)等5种方法提取北极深海沉积物宏基因组DNA。 2.沉积物宏基因组DNA纯化（腐殖酸是土壤DNA提取过程中极难去除的污染物，在PCR扩增时，极少量的腐殖酸，就会抑制DNA聚合酶的活性，干扰扩增结果） 电泳切胶回收 PEG8000纯化 在上述粗提沉积物DNA溶液中加入20L的4M的NaCl溶液与80L13%PEG8000溶液(w/v)，冰浴放置 30min;10000r/min离心15mim收集沉淀;用70%的酒精洗沉淀后11000r/min离心l0min;用灭菌的滤纸条干燥沉淀;加入40L的TE buffer。,3. 16SrDN

14、A基因PCR扩增 4. 16SrDNA基因PCR产物DGGE检测？ 5.优势条带的回收及PCR扩增 6. 回收条带的克隆 7.感受态细胞的制备 8. PCR产物的连接转化 9.质粒DNA提取 10. 阳性克隆的鉴定 11. 16SrDNAV3-V5区的PCR扩增及DGGE再鉴定确定位置？ 12.测序，序列分析，建树,DGGE变性剂浓度的选择，电泳时间的选择，染色方法的选择 电泳时间的选择： 采用了时间间歇(timetravel)的方法，每隔一小时加一次样，最终根据图谱清晰分离度来确定出最合适的时间。 染色方法的选择： EB染色后所显现的条带要少一些（只能染双链DNA，不能染单链DNA），所以这

15、种方法的灵敏度要低一些。相较而言，银染法的灵敏度就高了（因为它单双链DNA都能染色）。但是它无法顺利的从条带中回收出DNA。 因次在构建和观察指纹图谱时采用银染法。在要做回收克隆测序的工作时，则采用EB染色。,限制性片段长度多态性分析(RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism)RFLP技术的基本原理是根据不同生物个体或种群之间DNA片段酶切位点有所差异的特点，利用限制性内切酶进行消化，产生长短、种类、数目不同的限制性片段，然后对这些特定DNA片段的限制性内切酶产物进行分析。凡是可以引起酶切位点变异的突变包括点突变(新产生和去除酶切位点)、基因

16、插人或缺失(插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等均可导致多态性的产生。将PCR技术与RFLP分析相结合，用于研究环境中微生物多样性及群落分布，具体方法是采用特定的引物，如16S rRNA基因通用引物对环境样品的总基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物用不同的限制性内切酶酶切，通过电泳分析比较酶切带型，对特殊带型的序列进行测定，进而了解该样品中所包含的微生物序列信息。该方法广泛用于环境微生物多样性及其群落结构的研究。,末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP, Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) T-RFLP 技术与 RF

17、LP 技术基本原理类似，不同的只是在 其 中 一 条 PCR 引 物 的 末 端 加 上 荧 光 标 记 ， 如 TET(4,7,2,7-tetrachloro-6-carboxyfluorescein)，6-FAM (phosphoramidite fluorochrome5-carboxyfluorescein )等。在对目标基因如 16S rRNA 基因进行 PCR 扩增后同样采用不同的限制性内切酶进行酶切，产生不同长度的片段，电泳结果在测序仪上用基因扫描程序进行扫描，只有那些末端带有荧光标记的片段能够被检测到。简化了图谱，就可以用来分析复杂的微生物群落，以及能提供一些多样性的信息，因为

18、每一个可见的条带都代表一个单个的 OTU 或核糖体类型。通过这个图谱，可以计算种的丰度，均度，以及样品之间的相似性。这一技术能自动的分析大量的土壤样品，包括点样和分析。目前 T-RFLP 技术在微生物多样性及群落结构研究方面应用非常广泛。,东_西太平洋深海沉积物细菌多样性研究 采用土壤DNA快速提取试剂盒对样品的DNA进行了提取 琼脂糖凝胶电泳检测 16SrRNA 基因序列的PCR扩增（用FAM标记的引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和无标记的引物926R（5-CCGTCAATTCATTTGAGT-3）作为PCR扩增的引物对） PCR产物纯化与上样纯化（产物分别用H

19、ha I和Msp I 两种限制性内切酶进行酶切，并于37过夜。酶切产物分别用乙醇沉淀浓缩（乙醇终浓度为70%）。浓缩后的酶切产物用3100基因分析仪（ABI, USA）进行T-RFLP分析。Liz-500作为T-RFLP分析的分子内标） 末端限制性片段（T-RFs）统计与聚类分析（每一个峰即代表一个末端限制性片段，并且统计数值采用二元统计（有峰计为1；无峰计为0），按照统计数值进行聚类分析，以分析研究不同层位的细菌群落结构。）,16S rRNA 基因文库构建及序列分析 感受态细胞的制备 细菌16S rRNA 基因片断的扩增 PCR产物的纯化与连接 重组载体的转化 扩增的16S rRNA 基因基

20、因的限制性酶切分析 用水煮法快速提取细胞中的基因组DNA，用特定的引物进行PCR检测筛选的克隆是否是阳性克隆以及插入的片段大小是否正确，片断大小合适的PCR产物分别用Msp I和Hha I两种限制性内切酶进行酶切，酶切产物用4%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。根据酶切带型判断分类学单元（OTUs）的多少。,多样性覆盖率分析与稀释曲线分析 构建的16S rRNA基因文库的多样性覆盖百分率用公式：1 (m/N) 100计算，其中m是指每个16S rRNA基因文库中OTUs的数目，N是指每个文库总的克隆数。百分率越高表明文库多样性覆盖率越高。 16S rRNA基因测序及系统进化分析 通过两对引物确定目的基

21、因的插入方向，从而确定测序引物,当然仅仅依靠16SrDNA序列评估微生物多样性并不完全可靠的，例如16SrDNA序列同源98%，也可能是两个完全不同的菌属同时同种物种(古菌)也有可能相似性差异度达到5%。 荧光原位杂交（FISH）：是一种不依赖于PCR的分子生物学分析技术，可以较为准确快速和动态的观察微生物的种群变化，并同时提供形态数量和空间分布方面信息，同时可以克服核酸提取和PCR扩增过程中存在的偏差。 1.荧光显微镜 2.流式细胞术（Flow Cytometry, FCM） 选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征，它可以高速分析上万个细胞，并能

22、同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。,潜在的问题： 1.核酸回收过程中的偏差，并非所有类群的细胞都能同等有效的裂解，另外，与核酸一起被提取出来的腐殖质会干扰随后的酶处理步骤。 2.PCR及克隆过程中产生的偏差，由于PCR对某些模板的扩增具有有限性，从而导致对rRNA基因自然丰度的估计会产生潜在的偏差。可能会面临不同物种的基因序列互相集结形成聚合物的危险，PCR技术还面临着污染的问题。由于不同的细菌其染色体上的r RNA基因的操纵元的拷贝数并不一样，从而根据特定的r DNA克隆的相对丰度来估算其相应种群相对丰

23、度肯定也会产生偏差。,3.探针杂交反应：本以为是专一性的探针可能会与那些未曾被发现的序列发生交叉反应，或者那些虽然亲缘关系很近、但尚未被发现的新序列可能根本不与被设计用来与该类群的所有微生物种的r RNA杂交的探针起反应。进入细胞以后，探针还必须与互补的r RNA片段竞争，以便与它们的靶序列反应。灵敏性:当r RNA杂交探针用于具有高度多样性的样品的分析时，可能会遇到相当的困难。虽然原位杂交理论上可以检测到单一的特定的细胞，但要把这个被探针标一记的细胞放入显微镜检测的视野里并不容易。这种情况下，唯一的办法是将目标细胞“溶液”进行浓缩处理。,国际极地微生物考察研究在经历探险、观察、分类描述、获取

24、和保存样品、起源、系统和生理学之后,已开始转入起源、系统、生理及生物学适应机制及其它生态系统、能流、物流中的作用、地位研究。一些成果涉及微生物适应性机理的分子水平的探讨,以及活性物质的应用前景研究,并趋向作为一个分支而参与多学科、综合性的跨地区、跨学科的考察研究。 因此摆在中国学者面前的任务也必须高起点、高标准。就是要高瞻远瞩,有一个系统化的全面综合考虑。投入足量的经费、配备先进的仪器设施,吸引高素质人才,并积极参与国际项目的调查研究,如冰盖、干谷、内陆山脉、极地荒漠、冻土带、深海、环境等领域。尽力争取更多机会参与实地考察,为采集各种样品提供保障,以取得符合微生物学研究要求的第一手样品,为后续的精心研究提供支持。扩大研究内涵,并不断深化。从微生物的鉴定、生态环境、微生物与环境的相互作用,如在元素迁移循环、食物链/网/环、生态系统中的作用,治疗人体疾病及生物活性物质的开发利用等等,持之以恒地研究下去。 打好坚实的基础,注重原创性研究,尽可能高水准地科学认知、开发和利用好极地微生物这一宝贵资源,真正造福于全人类,并使之永久持续健康发展。,中国极地微生物考察研究的未来,