植物总蛋白提取(2页).doc

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1、-植物总蛋白提取-第 2 页一提取植物总蛋白（以植物花粉为例）：1.法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质，-20度 2个小时(必要时过夜)，4度 25000g离心20min后去上清，用含1%DTT的acetone溶液悬浮沉淀，-20度 1个小时,再次离心去上清，将的沉淀在等电聚焦缓冲液中(8M urea，20mmDTT,4%CHAPS,2%ampholyte,PH:3-10) 20度震荡1小时，20度25000g离心20min，收集上清，沉淀再次用IEF缓冲液离心收集上清，可

2、为后续试验做准备。2（phenol）提取法花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，添加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）继续研磨5min,加提取（0.1mol/L 8.8 Tr i s HCl，5mmEDTA,20mmDTT,30%sucrose）。将样本转移至离心管中，4度 震荡30min，25000g离心10min，将上层的phenol层转移进另一个试管，将下边的水相层加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）及提取缓冲液，震荡，离心，将再次收集到的phenol与前边收集的混合，加5倍体积的0.1 M ammonium acetate in 100%meth

3、anol，在-20度震荡沉淀蛋白质，必要时过夜，4度25000g离心10min，将沉淀用0.1 M ammonium acetate in 100%methanol及80% acetone各洗两次, 含10mmDTT的80% acetone再洗一次，在每一步中蛋白沉淀都要完全重悬 -20度震荡30min，4度25000g离心20min，洗剂完成后，沉淀真空，IEF buffer提取蛋白质，如方法1。3直接IEF buffer提取蛋白质直接IEF buffer提取蛋白质，花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，然后加入IEF buffer(8M尿素，20mmDTT,4%CHAPS，5m

4、mEDTA，5mmTris base,2%ampholyte,PH:3-10).如方法1。4Tris-HCL缓冲液法花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，加入Tris-HCL（50mm,8.8,Tris-HCL, 5mmEDTA,20mmDTT,100mmKCL,2mmPMSF）,在融化后，混合液在4度放30min, 25000g离心20min,收集上清，对重新提取一次，将收集到的上清混合，用5倍体积的100%沉淀，-20度孵育2h,离心后，用80%的丙酮洗剂沉淀2次，IEF buffer重悬沉淀，方法如15利用Bradford试剂法估测提取的总浓度，并调整浓度行蛋白电泳，-80度保存。本人翻译的，具体方法流程见附件原文。