动物细胞工程复习重点(4页).doc

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1、-动物细胞工程复习重点-第 4 页简述卵母细胞成熟的过程：婴儿时期：卵原细胞（位于原始卵泡内）经有丝分裂形成更多的卵原细胞。后者经染色体复制，形成初级卵母细胞（初级卵泡内），进而进行第一次减数分裂（简称减I期），并停留在减I期的前期的双线期。核成熟期：随着机体的生长发育，体内营养、激素水平，特别是激素水平的上升，原来停滞在减I期的初级卵母细胞恢复分裂，初级卵泡也迅速增大，逐渐变为排卵前的次级卵泡。在体内FSH、LH等激素的刺激下，初级卵母细胞彻底完成减I分裂，形成次级卵细胞和第一极体，并随卵泡的破裂排出到输卵管中。第二次减数分裂期：输卵管中的次级卵母细胞一边向输卵管壶腹部进发，一边进行第二次减

2、数分裂（简称减II期），并最终在壶腹部停留在减II期的中期。此时，卵母细胞若受精，则恢复减II分裂至彻底完成减II期，形成受精卵和第二极体，此时卵巢排卵破裂处的黄体持续存在（妊娠黄体），并大量分泌孕激素支持受精卵的发育和着床；若卵母细胞不受精，则暂停在减II期的卵母细胞则凋亡，此时卵巢上的黄体萎缩为白体直至逐渐消退，等待受体内激素水平调控的下一轮排卵周期的开始。简述成熟卵母细胞的结构与各组分作用：放射冠：由卵丘颗粒细胞组成的层叠状结构，一是起保护作用，形成卵母细胞的外围结构；二是其分泌的一些蛋白质因子等，可通过细胞间的紧密连接结构输送到卵母细胞内，促进卵泡的发育和卵母细胞的成熟。透明带（ZP）

3、：一是对卵母细胞起到赋予弹性的保护结构；二是在受精过程中参与对精子的识别（ZP3）和结合（ZP2），诱发顶体反应；三是通过透明带反应在防止多精受精过程中起重要作用。细胞膜：一是起卵母细胞膜内外物质、信息、能量交换的媒介作用；二是通过卵黄膜反应在防止多精受精过程中起作用。细胞质：主要是指皮质颗粒，皮质颗粒在精子进入卵母细胞内部激活卵母细胞的过程中，迅速与卵黄膜融合，发生皮质反应，进而引发卵黄膜反应和透明带反应，阻止多精受精。其他成分主要是大量mRNA及蛋白质，在受精后激活受精卵的发育和分裂中起到重要作用。简述精子发生的基本过程：精原干细胞先分化成精原细胞，后者经有丝分裂形成更多精原细胞，精原细胞

4、经染色体复制形成初级精母细胞，后者经过减I期，形成两个次级精母细胞，每个次级精母细胞再经减II期，形成四个精子细胞，后者再经变态反应，形成4个精子。简述精卵融合受精的主要过程：1穿入卵丘和放射冠。精子头部质膜上的透明质酸酶可水解卵丘颗粒细胞之间的连接结构，使得卵丘细胞松散，精子在尾部摆动的作用下穿透卵丘，到达透明带。2识别与结合卵母细胞：精子质膜上ZP3受体与卵母细胞ZP上的ZP3结合，在精子尾部供能下，粘附于卵子，同时诱发顶体反应。随后，精子质膜上的ZP2受体与卵子ZP2结合，使精子紧密结合于卵子上。3顶体反应：精子顶体释放的酶溶解透明带等外围结构（顶体酶溶解透明带，透明质酸酶松解卵丘，酸性

5、蛋白酶溶解放射冠，芳香基硫酸酯酶溶解卵黄膜等）。4穿越ZP和卵黄膜：顶体反应释放的酶的酶解及精子尾部的机械运动，使得精子最终进入卵母细胞内部。5精卵融合：精子进入卵质后，除染色质结构外，其他结构降解，随后染色质解凝集，DNA重新与组蛋白结合，并逐渐形成雄原核。6卵子激活：随着精子的入卵，卵母细胞恢复减II分裂，激活卵母细胞的分裂及其他反应，其中以皮质反应所引发的透明带反应及卵黄膜反应，在防止多精受精过程中起重要作用。7原核的形成：卵子激活后的结果之一便是彻底完成减数分裂的卵母细胞细胞核逐渐形成雌原核，然后雌雄原核行DNA复制并相互靠近并发生膜融合，至此受精结束。简述缩短细胞一代时间里的潜伏期的

6、常用方法：增大细胞密度；选择合适的培养对象（幼小动物、传代细胞、胚胎细胞）；创造良好的培养条件（培养基、血清浓度、合适的瓶壁底物）；培养基中额外添加促粘附物质（纤粘连蛋白）什么是BSS？有何作用？在实验室操作中BSS主要用于那些操作？BSS是指平衡盐溶液；生理作用为细胞提供生理性渗透压和pH值的生长、生活环境；常用于洗涤组织、细胞及配制胰酶及培养基时作为溶剂。什么是完全培养基？其中血清的主要作用是什么？血清使用之前为什么要进行灭活处理？如何进行？完全培养基=合成培养基血清（10-20%）双抗；血清主要作用是促进培养细胞的生长、贴壁、分裂；主要为灭火补体，方法为5630min水浴。胰酶在原代培养

7、和传代培养中的消化对象和消化方法分别是什么？原代培养的消化对象为活体组织块，方法一般为胰酶37摄氏度消化30min（视消化对象有所不同，但总的时间比较长），每隔5min摇匀一次；传代消化对象为贴壁细胞，方法为室温或37消化2-3min，直至镜下由细胞变圆或瓶壁上出现空洞为止。细胞培养之前为什么要进行细胞计数？细胞常用培养密度大约是多少？为了保持合理的细胞密度，密度太高需频繁换液容易污染，且有贴不了壁的细胞会死亡，密度太低，细胞分泌的相互促进生长的生长因子阈值不够，细胞生长不好。常用密度为10的5-6次方个/ml。什么是干细胞？如何分类？干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,能产生表型和基因

8、型与自己完全相同的子细胞，并具有不同分化潜能。分类：胚胎/成体干细胞；全能/多能/单能干细胞；神经/骨髓造血/肝/干细胞。干细胞有什么生物学特性？增殖与分化特征：永生化且能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；能参与胎儿所有组织的发育过程； 形态特征：体积小、核大，核仁明显；胚胎干细胞克隆紧密堆积，细胞之间无明显的界限，细胞克隆有一定形状规律。生化特征：具有碱性磷酸酶和端粒酶活性；表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等表面标志；表达OCT-4蛋白； 简述来源于ICM的胚胎干细胞分离方法直接分离法：囊胚于饲养层上自行发育成孵化囊胚，待ICM扩大增殖时

9、挑取。或使用链霉蛋白酶处理ZP，获得裸胚培养。免疫分离法：链霉蛋白酶去除囊胚晚期胚泡ZP，依次转移至补体灭活和未灭活的抗血清中，去除滋胚层细胞后，吸取ICM，移至饲养层培养。PEG是目前最常用的细胞融合方法，请以小鼠骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的融合为例，简述实验步骤。108小鼠脾细胞与107骨髓瘤细胞混合，离心（1000rpm，10min），弃上清。轻扣管底，混匀细胞， 37水浴。60s内滴加0.6ml 50PEG，边滴边摇动试管，30s内将细胞悬液吸入吸管静置30s，再在30s内缓慢转入离心管；5min内后加入10mlDMEM终止PEG作用。离心，弃上清，加15mL HAT培养基，混匀，转入96

10、孔板（预先有HAT培养基培养的饲养细胞），每孔100 ul。37孵箱孵育，2-3天换 HAT一次，持续2周。阳性杂交瘤细胞的克隆培养过程中往往需要制作饲养层细胞，最常用的饲养细胞是什么？其饲养原理是什么？饲养原理：提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易生存与繁殖。腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而促进单个细胞克隆的生长。饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进细胞分裂、增殖的作用。常用细胞：小鼠腹腔巨噬细胞选用小鼠骨髓瘤细胞作为融合的亲本细胞之一时对骨髓瘤细胞有哪两个最基本的要求？HGPRT酶和TK酶基因不表达；自身不合成抗体，也不干扰杂交瘤细胞合成抗体。ESC培养时常用的饲养层细胞有哪

11、些？其作用是是什么？鼠胚成纤维细胞最为常用（如STO细胞株）；饲养原理：提供促进ESC生长、分裂的生长因子；提供抑制ESC分化的生长因子。比较雌激素与孕激素生理作用的对抗点：对卵巢，雌激素主要起活跃卵巢功能，孕激素则强烈抑制卵巢的活动。对子宫，雌激素主要促进子宫平滑肌收缩等功能，孕激素则起抑制收缩，分泌子宫乳等促进安胎的作用。对乳腺，两者均能促进乳腺腺泡发育。简述试管动物技术的一般技术流程：卵母细胞的采集与体外培养；精子的采集与体外获能处理；受精液微滴中精卵细胞的融合；受精卵胚胎的体外培养；移植受体，妊娠产犊。动物细胞工程：以动物细胞或其组成成分为研究对象，以细胞生物学、发育生物学、生殖生物学

12、和分子生物学的理论和技术为基础，结合工程学原理和技术，对细胞或其组分进行操作、加工或改造，使其按照规定目的发生结构或功能等生物学特性的改变，获得人类所需生物产品或创造新品种的学科。组织工程三要素(细胞、支架、信号)研究内容：动物细胞、组织和器官培养、动物细胞融合及杂交瘤技术、动物染色体工程、动物干细胞工程、转基因动物及生物反应器、动物胚胎工程、嵌合体技术、动物克隆技术。精子发生场所：睾丸；精子发生时间：初情期生殖机能衰老精子细胞变形中的主要变化：细胞核精子头的主要部分；高尔基体头部的顶体； 中心粒精子的颈部；线粒体线粒体鞘；细胞内其他物质原生质滴。原代培养：从体内取出组织或细胞接种培养到第一次

13、传代的操作过程。传代培养：细胞培养增殖到一定密度时，将细胞重新悬浮，经稀释后接种到新的细胞培养瓶中的过程称为传代培养。细胞系：初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞称为细胞株。接触抑制：贴壁细胞在瓶壁上相互接触后，生长和分裂行为受到抑制的现象。汇合：贴壁细胞生长分裂后在细胞瓶壁上相互汇集在一起的状态。下丘脑-垂体-性腺轴：机体内外的刺激，通过感受器产生的神经冲动，传到下丘脑，引起促性腺激素释放激素（GnRH）分泌；释放激素经下丘脑的门静脉系统运至垂体前叶，导致促性腺激素释放（FSH、LH等），促性腺激素经血液循环到达性腺，调节性腺的机能，使性腺分泌相应的激素（如雌激素、孕激素、雄激素等）。当性激素增加到一定水平时，又可通过负反馈作用，使释放激素和促性腺激素的分泌减少，最终使生殖激素处于机体所需要的水平。精子获能：指体外受精过程中精子经历复杂生理生化变化，获得穿越卵母细胞透明带进行受精的能力的过程。发育阻滞：指动物早期胚胎体外培养到某一特定阶段时，受精卵的发育突然停滞的现象。