临床PCR检验的室内质控2017年度版.ppt

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1、临床PCR检验的室内质控方法,卫生部临床检验中心 李金明 2017年10月,存在的问题,概念不清 不知道具体怎么做 不会写室内质控的SOP 不知道如何选择室内质控物 不会分析室内质控的结果,室内质控SOP存在的问题,责任人不清。 质控物的来源及浓度不清或不全，并且通常没有说明阴性质控物的来源。有些是自制，但制备方法不规范，没有任何的质量检验，定量结果没有溯源性。 没有明确所选用的质控方法。对前20次的测定的室内质控没有解决方法。 没有明确的失控判断标准，只是做了一些失控的含糊叙述。并且一般都没有阴性失控的判断方法。 没有失控后的分析及处理措施。,室内质量控制（Internal Quality

2、Control,IQC)的概念,由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。 可概括为:(1)执行者：实验室技术人员；(2)目的：监测实验室测定的重复性；(3)功能：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的即时性评价。,室内质量控制（IQC）的基本内容,主要包括三个方面： （1）测定前的质量控制； （2）统计学质量控制； （3）质量控制的评价。,测定前的质量控制,实验室设施、仪器设备及管理 理想的试剂和操作方法 人员培训,

3、实验室设施、仪器设备及管理,实验室空间及工作流程的设计 实验室环境条件的控制：温湿度控制设备、稳压或不间断电源,理想的PCR实验室设计A,理想的PCR实验室设计B,临床PCR实验室设计的一般原则,各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作,“十六字口诀”,传递窗,传递窗,传递窗,临床PCR实验室质量管理的特点,“无基因”概念 实验室要有严格的人员进入限制和程序 使用合格的试剂和消耗品,PCR实验室“污染”的主要来源,临床标本中存在的大量待测微生物 科研中得到的质粒克隆 以前分析研究的特定微生物 大量存在于实验环境中的特定微生物 以前扩增产物的残留污染。这也是PCR实验室最容易产生的将造成假阳性的“

4、污染”。,PCR实验室的重要防“污染”措施,实验室的严格分区及工作程序的严格遵守 化学方法：实验台面可使用10的次氯酸钠（漂白剂）清洗 ；有些物品比如放置扩增反应管的盘必须从污染区转回到清洁区时，在转回之前，应将其置于210的次氯酸钠溶液中过夜，并充分冲洗。 紫外照射：实验台面、仪器设备、实验室空间 UNG,仪器设备及管理,PCR仪、离心机、加样器、恒温设备等应建立技术档案，并定期维护;PCR仪、加样器、恒温设备应定期进行校准,理想的试剂:试剂的质检,核酸提取或标本处理方法的抗干扰能力（能否 有效地去掉PCR抑制物） 测定下限(Detection limit)（定性测定） 测定准确性和线性范围

5、 批内变异和批间变异 试剂批间的一致性 有否污染 其他：外包装、试剂的完整性、有效期、说明书等,理想的操作方法,按照试剂盒说明书操作即可吗? 操作中影响测定结果的关键环节 写出具有可操作性的SOP,人员培训,培训所涉及的范围:仪器设备使用、维护和校准；试剂、方法原理；质量管理体系；相关法律法规、相关领域的新技术、新理念和新进展；实验操作技能等。 如何培训：讲座、讨论、自学和参加培训班等。 培训的评估：书面考试、实验考核、讨论心得、论文、综述等。,统计质控方法,质控物浓度的选择 每次（批）测定质控物的数量及放置 质控规则 Levey-Jennings质控图方法 “即刻法”质控方法 “假阳性”的统

6、计质控方法,质控物浓度的选择,定量测定：测定线性范围内的高、中、低三种浓度 定性测定：接近方法测定下限的浓度 阴性质控物,每次（批）测定质控物的数量及放置,标本数量如小于30，弱阳性和阴性质控各1份，标本数量增加，质控物数量相应按比例增加 均匀分散于临床标本中，与临床标本一同处理（核酸提取） 扩增时的排列顺序，可排于标准品或校准品之后，临床样本之前。但在扩增仪中的位置，不应永久性的固定的在一个孔，而应在每次扩增检测时，进行相应的顺延，以使在一定的时间内，可以尽可能的监测每一个孔的扩增有效性。,阴性质控样本的种类,阴性原血清样本 实验过程中带入的空管 仅含扩增反应混合液的管,阴性原血清样本的功能

7、,监测实验室的以前扩增产物的“污染” 由实验操作所致的标本间的交叉污染。具体地说，如强阳性标本气溶胶经加样器所致的污染、强阳性标本经操作者的手所致的污染、使用翻盖离心管核酸提取时在较高温孵育时盖子崩开等 扩增反应试剂的污染。,核酸提取过程中带入的空管,监测核酸提取过程中的实验室“污染”的存在（在整个实验过程中，开口放置于核酸提取的操作台面区域内，最后以水为基质，进行扩增 ）,仅含扩增反应混合液的管,监测试剂的“污染”,质控规则的表达方式及定义,质控规则的表达方式 质控规则的功能 常用质控规则的符号及定义,质控规则的表达方式,通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值

8、的个数，L为控制限，通常用均值或均值13SD来表示。 当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。 常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。,质控规则的功能,简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。,常用质控规则的符号及定义,符 号 定 义 12S 一个质控测定值超出2s控制限。 13S 一个质控测定值超出3s控制限。 22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限。 R4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的 差值超出4s控制限。 41S

9、四个连续的质控测定值同时超出+1s或1s控制限。 7T 七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变 化。 10X 十个连续的质控测定值同时处于均值（）的同一侧。,Levey-Jennings质控图方法,也称Shewhart质控图，是由美国的Shewhart于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。 二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制 。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。,质控图,Levey-Jennings质控图基本的统计学含义,稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（

10、95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。 如以3s为失控限，假失控的概率为0.3%。,“即刻法”质控方法,“即刻法”质控方法的实质是一种统计学方法，即Grubs异常值取舍法 ； 只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。,“假阳性”的统计学室内质控方法,基于日常检验的阳性率比值(呈正态分布) 直接概率计算方法（不呈正态分布）,基于日常检验的阳性率比值,半Levey-Jennings质控图法,质控规则,当阴性质控样本为阳性时,不管阳性率测定比值为何，均为失控，所有阳性标本须重新测定，并增加一倍阴性质控样本。 如果阴性质控样本为阴性，某次

11、测定阳性比值超出+3SD,则为失控,为1+3S规则。本次结果阴性结果根据阳性质控样本的情况,决定是否可以发出,所有阳性样本结果不能发出，需查找出现阳性率增高的原因，并在增加一倍阴性质控样本的情况下重新检测。,可能的几种失控表现,曲线向上漂移：提示出现污染，污染可能是由于某一天操作上的失误导致实验室被污染如标本泄漏，产物泄漏，试剂被污染等 向上的趋势性变化：可能存在累积性的产物污染，实验室扩增产物逐渐累积，从而使病人结果的阳性率逐渐增高。此时实验室需要进行彻底清洁。,直接概率计算法,按统计学规律，一个事件发生的概率小于5%被称为小概率事件，即发生的可能性很小。 当一个小概率事件发生时，则可能有误

12、差存在，有必要对其发生的原因进行分析。 对每天的日常病人结果中阳性率出现的概率进行计算，如果这种结果出现的概率小于5%时，则可判为失控。,根据二项式分布的概率计算,在一个实验室中某检测项目结果的阳性率为p,计算在n个血液样本中有k个阳性结果的概率。根据二项式分布的概率计算公式如下： P(X=k)=n!/k!(n-k)!pk(1-p)n-k (1) 其中n为当次实验检测标本数，k为阳性个数，p为阳性率。 P(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。,根据二项式分布的概率计算,如果一个实验室检测HBV DNA，平常病人结果的阳性率为10%，即p=0.1, 在某

13、一次检测25个样本出现6个阳性结果，19个阴性结果，则检测过程中是存在污染的可能性可通过下述方法计算。即计算在25个样本中出现6个或6个以上阳性结果的概率，此时的概率为1-（获得0个或1个或2个或3个或4个或多5个阳性结果的概率）即： 1-P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)=1-(1-0.1)25+25(1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15=0.0334 则在这个实验室一次检测25个标本获得6个或6个以上阳性结果的概率为3.34%，小于5%，属于小概

14、率事件，即发生的可能性很小，可能有污染所致假阳性结果的可能。,根据泊松分布的概率计算,在血液筛查检测中，许多实验室或检测项目如HCV RNA 、CT、结核杆菌、淋球菌的阳性结果率均较低，这时虽然可以使用公式（1）计算概率，但如果标本量很大，使用泊松分布来估计二项式分布是一种更为简便的方法。根据泊松分布，可使用下式计算概率： P(X=k) =(np)ke-np/k! (2) P(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。,根据泊松分布的概率计算,一个实验室中，某项目每次检测结果的阳性率约为2%，则在100个样本中出现8个阳性结果的概率。 根据泊松分布，可使用公

15、式（2）计算概率，此时n=100,p=0.02,k=8, np=2代入公式（2）计算得 P(X=10) =28e-2/8!=0.0009。,标本间交叉污染的概率计算,如果所有阳性结果的出现是连续性的，则可能存在标本间的交叉污染，即阳性样本污染了它邻近的阴性样本，这种情况的概率计算公式如下： P=(n-r+1)/n!/r!(n-r)! （3） 其中n为当次实验检测标本数，r为连续出现阳性的个数。 当某次实际测定标本连续阳性的概率大于所计算的概率，则判为失控。阴性标本结果可以发出，阳性标本要考虑标本间交叉污染的问题。,标本间交叉污染的概率计算,如在一次检测100个标本的HBV DNA检测中，所有两

16、个阳性结果连续出现的概率为： P=(100-2+1)/100!/2!(100-2)!=99/4950=0.02 概率为2.0%。 因此，如在100个标本中，连续出现两个为阳性次数有3次，即概率为3.0%，则为失控。 而在一次检测100个标本，所有三个阳性结果连续出现的概率为： P=(100-3+1)/100!/3!(100-3)!=98/161700=0.0006 概率为0.06%。 因此，如果如在100个标本中，连续出现三个为阳性次数有1次，即概率为1.0%，为失控。,室内质量控制的评价,IQC是一个集体活动，不光是对实验室一次测定的有效性的判断，也反应了实验室测定趋势的变化。 IQC的失控

17、不能做为处罚的依据，应建设性的找出失控的原因，针对其采取措施加以改进。 对IQC应定期进行评价。,阳性质控样本失控的常见原因,核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留、所用耗材如离心管有PCR抑制物等。 仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。 试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。,避免假阴性的措施,纯化核酸 标本重复双份测定 稀释标本 使用“内质控”（Internal Control,IC),阴性质控样本的常见失控原因,扩增产物的“污染” 临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉 “污染”,避免PCR检验假阳性结果的措施,严格的实验室分区 使用带“滤芯”的吸头 设立“阴性”质控（与标本同时处理） 使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂 临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌、淋球菌等经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。,IQC的局限性,IQC可能测不出的误差 测定前 测定中 测定后 样本鉴定不对 样本吸取不对 结果记录错误 样本贮存中变质试剂加入不对 此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一般要求小于0.1%，且应均衡地分布于测定前、测定中和测定后的不同阶段。,谢谢！,