消毒剂验证方案(8页).doc

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1、-消毒剂验证方案-第 8 页消毒剂验证方案Disinfectants Validation Protocol编号Code: 版本Version: 编写Prepared by:日期Date:审 核 人 日 期 Reviewed by Date批准Approved by:日期Date:变更记录Change Log版本号Version变更描叙Description变更细节Section changed批准日期Release Date目 录Contents1.简介42.实施日期43.验证小组名单44.材料与试剂45.设备和仪器56.中和剂鉴定试验57.载体定量杀灭试验78.现场考察试验79.附件810

2、.相关SOP811.修改事项812.再验证813.文档81. 简介 消毒剂常用于设备设施表面消毒。本公司使用的消毒剂有75%酒精、0.1%新洁尔灭、2%来苏尔和6%过氧化氢。其中0.1%新洁尔灭主要用于墙面、地面和门的表面消毒，75%酒精和6%过氧化氢主要用于设备、操作台面、门把手消毒，2%来苏尔主要用于地漏消毒。本方案结合特定菌挑战试验和现场考察试验，对消毒剂的杀菌效力进行确认。2. 实施日期项目中和剂鉴定试验 载体定量杀灭试验现场考察实施日期3. 验证小组名单部 门姓 名职 责批准方案、报告QA审核验证方案、记录和报告QC审核验证方案、记录和报告生产部审核验证方案、记录和报告QA编写和实施

3、验证方案QA现场微生物监测取样QC实施验证方案4. 材料与试剂4.1 菌株 （1）细菌： 金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26003大肠杆菌CMCC(B) 44102 （2）细菌芽孢：枯草杆菌芽孢CMCC(B) 63501（3）真菌：白色念珠菌CMCC(F) 980014.2 培养基营养肉汤培养基：营养肉汤培养基纯化水 1000ml将上述成分混合后，加热至完全溶解，调pH至7.10.2，分装，于121高压蒸气灭菌15min备用。营养琼脂培养基：营养琼脂培养基粉纯化水 1000ml将上述成分混合后，加热至完全溶解，调pH至7.10.2，分装，于121高压蒸气灭菌15min备用。改良马丁培养基： 改

4、良马丁培养基粉 28.0g 纯化水 1000ml将上述成分混合后，加热至完全溶解，调pH至0.2，分装，于115高压蒸气灭菌20min备用。改良马丁琼脂培养基： 改良马丁琼脂培养基粉 42.0g 纯化水 1000ml将上述成分混合后，加热至完全溶解，调pH至0.2，分装，于115高压蒸气灭菌20min备用。4.3 稀释液：1%蛋白胨-PBS溶液4.4 中和剂：0.1%卵磷脂+1%吐温80溶液1%硫代硫酸钠溶液+0.3%卵磷脂+1%吐温80溶液4.5 无菌试管4.6 无菌平皿(90mm)4.7 含玻璃珠的无菌三角瓶4.8 消毒剂：75%酒精，0.1%新洁尔灭，2%来苏尔，6%过氧化氢4.9 移液

5、器及配套无菌吸头:0-100ul，100-1000ul4.10 计时器5. 设备和仪器5.1 HS-1300-V型净化工作台5.2 电动混合器 5.3 SHP-150型细菌培养箱5.4 GNP-9270型生化培养箱5.5 人工菌落计数器6. 中和剂鉴定试验 6.1 细菌和真菌菌液制备接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，3035培养18-24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，2328培养18-24h。将上述培养物用稀释液稀释至所需浓度备用。6.2 枯草杆菌芽孢悬液的制备 取枯草杆菌新鲜培养物（18-24h）适量至营养琼脂培养基斜面，使菌液布满营养琼脂培养基斜面，再将

6、多余的培养物吸出，将斜面置于3035培养57天。用接种环取菌样少许涂于玻片上，进行芽孢染色镜检。当芽孢形成率达95以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。 加适量无菌水于每一营养琼脂培养基斜面试管内，以接种环轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再取适量无菌水于营养琼脂培养基斜面，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶内，振摇5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。 用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，清除其中的琼脂凝快。 将过滤后的芽孢悬液放于80水浴中10min以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存

7、于4冰箱中备用。有效使用期为半年。 芽孢悬液在使用时，应先进行活菌计数。6.3 染菌载片制备 载片脱脂处理：将载片放在含肥皂的水中煮沸30min，以纯化水洗净，用纯化水煮沸10min，用蒸馏水漂洗至pH中性晾干备用。 菌液滴染：将经灭菌的载体平铺于无菌平皿内，滴加105cfu/ml的菌液10ul，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，载体置37温箱内干燥约20-30min后再使用。6.4 中和剂鉴定操作程序 根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。 第1组：用无菌镊子取一染菌载片移入含有10ml中和剂的试管中。作用10min后，用电动混合器混合20s，或将试管振打80次，混匀，分别吸

8、取1.0ml，接种于两个平皿中，做活菌计数。细菌放3035培养48h，芽孢放3035培养72h，真菌放2328培养72h观察最终结果。 第2组：用无菌镊子取一染菌载片移入含有10ml中和产物（以浸有消毒剂的无菌载片置10ml中和剂内，作用10min）的试管中。作用10min后，用电动混合器混合20s，或将试管振打80次，混匀，分别吸取1.0ml，接种于两个平皿中，做活菌计数。细菌放3035培养48h，芽孢放3035培养72h，真菌放2328培养72h观察最终结果。 第3组：用无菌镊子取一染菌载片移入含有10ml稀释液的试管中。作用10min后，用电动混合器混合20s，或将试管振打80次，混匀，

9、分别吸取1.0ml，接种于两个平皿中，做活菌计数。细菌放3035培养48h，芽孢放3035培养72h，真菌放2328培养72h观察最终结果。 第4组：分别吸取稀释液和中和剂各1.0ml于同一无菌平皿内，加入上述试验同批次的培养基15-20ml，培养观察。 判定标准 实验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格： 第1、2和3组有相似量试验菌生长，其组间菌落数误差率不应超过15%。第1、2和3组菌落数误差率计算公式如下： （3组间菌落平均数-各组菌落平均数）的绝对值之和误差率10033组间菌落平均数 第4组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应重新进行试验。 结果记录附件1：中和剂鉴定试验结果记录

10、7. 载体定量杀灭试验7.1 将菌液用稀释液稀释成 108cfu/ml的菌悬液。7.2 取已灭菌的载体放于无菌平皿内，每种微生物试验用载体分5分钟组、10分钟组和15分钟组共3组。7.3 滴染108cfu/ml的菌悬液10ul于无菌载体上，载体置37温箱内干燥 约20-30min后再使用。7.4 用无菌镊子将染菌载体加入含有消毒剂的平皿中，作用至规定时间，将染菌载体移入含有10ml中和剂的试管内，用电动混合器混合20s，或将试管振打80次，使菌片上的微生物被洗脱进入中和液内，再放置5 min，使中和作用充分。最终进一步混匀，适当稀释，分别吸取1.0ml接种于两个平皿中，做活菌计数。细菌放303

11、5培养48h，芽孢放3035培养72h，真菌放2328培养72h观察最终结果。7.5 另取一平皿，注入10ml稀释液代替消毒剂，放入染菌载片，作用10min后取出载片，移入含有10ml中和剂的试管内，其随后的试验步骤与上述试验相同，作为阳性对照。7.6 判定标准消毒剂对挑战菌的杀灭对数值3判为合格。7.7 杀灭对数值计算杀灭对数值（KL）对照组平均活菌浓度对数值-试验组活菌浓度对数值7.8 结果记录附件2：载体定量杀灭试验结果记录8. 现场考察试验8.1 消毒剂的配制：洁净区操作人员按照车间消毒剂的配制和使用（SOP 034401）配制75%酒精、0.1%新洁尔灭、2%来苏尔和6%过氧化氢。8

12、.2 生产结束后操作人员按照车间生产区清洁（SOP 030492）对洁净区进行清洁消毒。8.3 清洁消毒完毕15分钟后，现场QA使用接触皿对清洁消毒后的洁净区进行表面微生物监测取样，共测定3次。表面微生物监测位点详见附件3。8.4 测定结果记录附件4：洁净区表面微生物监测结果记录8.5 合格标准符合10万级洁净要求。9. 附件10.1 中和剂鉴定试验结果记录10.2 载体定量杀灭试验结果记录10.3 表面微生物监测点10.4 洁净区表面微生物监测结果记录10. 相关SOP文件编号文件名称车间消毒剂的配制和使用车间生产区清洁微生物实验室管理物品进出微生物检验室微生物检验区的清洁消毒培养基的配制细

13、菌的接种、传代和保存高压灭菌微生物数量的测定11. 修改事项在实施过程中，如果方案需要修改，必须提交书面的报告，阐述修改的原因，修改的内容，并经过相关部门及QA的认可。修改后的方案同先前执行的方案一起归档。12. 再验证12.1 当消毒剂的使用浓度和清洁消毒程序发生变更时应进行再验证。12.2 当环境中出现新类型的微生物时，应以该微生物为挑战菌进行再验证。12.3 当有新的消毒剂被使用时应进行验证。13. 文档所有的相关文档都应该保留至少10年，这些文档应包括如下内容：原始方案，修改后的方案，偏差报告，原始数据，原始报告和最终报告。其中，报告应该包括以下内容：记录的拷贝，测试项目及条款，试验开始和结束的日期，材料和方法描述，出现的偏差描述（如果有的话），试验结果和文档描述。方案结束