液相常见问题(7页).doc

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1、-液相常见问题-第 7 页液相的常见问题：一、 在实际工作中，我们经常能遇到基线的漂移的情况。关于基线漂移（或上下波动）的原因，可能有以下几种：1、柱子的平衡时间长。一般来说，新柱子的平衡时间要短。有些老柱子的平衡是时间长。当然，柱子的平衡是时间也和它使用的流动相有关系。如果使用了离子对试剂，那么比普通的简单的流动相（例如 二元流动相：甲醇：水，乙腈：水，）2、系统存在漏点。如果系统存在漏点，那么出现基线向下漂移。需要检漏3、PUMP头有气泡。PUMP头的气泡会导致基线的漂移和波动。如果怀疑是PUPM头有气泡导致基线不稳，只需要看仪器的压力是否稳定就好。4、流动相脱气。如果流动相没有脱气，基线

2、肯定是不稳的5、柱后气泡。在柱子后有气泡产生，导致检测器中的读数有波动。6、PUMP密封不好。密封不好，也会导致PUMP头的气泡（好象不可能）和漏夜，基线当然不稳定了。7、系统的环境。仪器的使用，如温度的变化，流速的变化，以及梯度洗脱，当然基线漂移8、单向阀睹塞或污染。单向阀的睹塞和污染，能造成流量不准确，压力 波动。故也会波动，漂移9、检测器污染或有杂质 10、 如果是紫外或二极管阵列检测器（PDA），排除以上原因还出现基线噪音大，就有可能是氘灯的能量不足了二、主峰后面有很多杂质峰可能原因1，仪器问题：最有可能的就是系统污染，尤其是管路，比如，入口单向阀或各接口处等有盐残留；2，色谱柱问题：

3、这个好办，换新的色谱柱，大部分能解决问题；3，试剂试药问题：所用试剂、试药达不到色谱级别所需，或者不同批号不同厂家的东西都有可能影响，最直接影响的就是物质的纯度影响流动相的吸收；4，梯度洗脱程序：梯度洗脱程序设置不合理，比如在某个时间段急剧变化；5，其他：如配制方法不同，超声方法不同等。如今，看似很简单的问题，在经过很长一段时间的摸索后发现，上述原因其实都是比较客观的，如果以上4点都解决不了，可以考虑以下原因：仪器本身功能上的区别导致。比如安捷伦低压梯度和高压梯度做的同样的东西，能重复出来，而且梯度峰都很小，甚至没有，而用岛津的低压和高压梯度仪器，所表现的就不一样了，具体原因，因只具有经验所得

4、，所以目前只能作为讨论的一个话题，仅供各位参考。 三、冲洗液相管路1、如果系统污染可以考虑用异丙醇冲洗，把过滤后的异丙醇当流动相，以0.5ml/min冲洗30-60分钟，一般杂质就可清除。如果不行可以考虑12%的磷酸冲洗，它可以有效清洗不锈钢和其它材料的管路，清除有机杂质及污垢，比用有机溶剂更有效，也比用稀硝酸有效（用5-15%硝酸清洗虽然有效，但是清洗后系统很难平衡，特别低紫外区域）。磷酸清洗方法如下：先用甲醇或者乙腈彻底清洗系统，然后是纯水，然后是12%磷酸冲洗60分钟左右，冲洗过程中可以将进样器一并冲洗，然后换用水，甲醇或乙腈冲洗，这样就基本可以了。 2、用5%硝酸洗脱管路1h后未知峰去

5、无踪，效果不错，推荐大家有必要试试如果不是污染严重，还是别用硝酸洗脱管路，因硝酸对不锈钢管路损害较大四、 梯度洗脱做梯度洗脱有时候是会这个样子的，基线会漂移的满厉害的。要用足够的时间来平衡，如果有在线脱气装置会好一点。特别是走梯度洗脱时后面往往有一些杂峰而有机相在不同的比例下吸光度也不一样，由于UV检测的是相对吸收度，所以就造成了基线漂移。而且，如果柱子没有平衡好，这种漂移也不一样。如果走上两个小时后，这种漂移相对就稳定。在梯度分析时，流动相的选择和波长的选择是很重要的；在梯度洗脱时，一般波长不应再变，否则再高的水平也做不好，尤其在低波长时。 分析波长较高时，流动相相对容易些，如在300nm以

6、上，影响相对较小。但是，在大多数的情况下，流动相首选低紫外吸收的，如乙腈和水，少用甲醇和四氢呋喃，无机盐以磷酸盐等低紫外吸收的为好，少用醋酸盐、柠檬酸等有机盐，酸用磷酸和硫酸少用醋酸，同时梯度变化尽可能小和缓和，虽然分析时间将增加。另外，A，B（C）相都采用混合流动相，以减少流动相变化对紫外的影响。还有一点，所用的试剂要求为色谱纯，国内有的厂家所标的色谱纯连化学纯的都不如，有一些特定的添加试剂，如离子对试剂，只能使用进口的色谱纯级。注意以上几点，你的梯度色谱图必将大有改观。当然你的仪器也要好的了。 建议您使用一种方法：扣除本底法。此种方法由色谱工作站来完成，具体方法是：1、不进样，严格按梯度方

7、法空跑出基线，得出不进样的梯度基线。2、进样，做梯度洗脱，得到谱图。3、在工作站上用谱图相减的功能处理，用谱图减去梯度基线，即可得到比较漂亮的谱图，而且不影响定量计算！五、样品池污染1、如果是流通池脏，可以把柱子去下来，用5050（v/V)的异丙醇、异丙醇纯水、来冲洗流通池。如果还不行，用1N的硝酸冲流通池，再用纯水冲洗。 2、液相管路脏、样品池脏、样品池能量比参比池低很多，处理方法：不接柱子，接上二通管，用8%硝酸冲洗2小时，纯水冲洗2小时，用甲醇过度，接着用异丙醇冲洗2小时，最后过度成甲醇。结果：基线平稳，峰行明显改善，样品池能量恢复六、异丙醇的作用：在安捷伦液相中会使用的10异丙醇，它的

8、作用是柱塞清洗附件的清洗液，它主要是当流动相中含有盐类时，为了防止盐类在柱塞产生结晶，磨损宝石杆和柱塞密封圈，加入异丙醇10异丙醇一方面有防止长菌的作用，另一方面有增加清洗液的润湿性，减少泵内气泡产生。在泵运行的时候一定不能干。异丙醇是一个很特殊的角色，是维护液相的专业溶剂，它的“露面”至少有以下几处：1、10%的异丙醇是柱塞清洗附件的清洗液。2、更换密封圈后用异丙醇磨合。3、洗针用溶剂。4、峰拖尾时，可尝试用异丙醇冲柱子。5、泵的压缩性补偿值，是以异丙醇为基准：标准的100，而常用的流动相：甲醇120，乙腈115，而水则偏差较大，是46。6、正相和反相系统转换时的中间过度溶剂。另外在其他厂家

9、的液相中使用30甲醇，作用都是和异丙醇的一样，用于洗泵和洗针。七、检测限与定量限S/N=3时的浓度是检测限，也就是峰高约在基线噪音高的3倍，注入液相色谱仪的对照品百分浓度。S/N=10是定量限，也就是峰高约在基线噪音高的10倍时，注入液相色谱仪的对照品量。首先，配制一个较低浓度的对照品溶液，注入液相色谱仪，观察其峰高比基线噪音高多少倍（假设X倍），将该溶液稀释到X/3倍，基本即为该物质的检测限，将该溶液稀释到X/10倍，基本即为该物质的定量限。在新的“指导原则”中提到了检测限和定量限，以检测限为例：“检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。”“无论用何种方法，均应用

10、一定数量的样品，其浓度为近于或等于检测限，进行分析，以可靠地测定检测限。”其中第一句中指出是最低量，但第二句中又类比为浓度，所以，可以看出，官方对这个概念的定义也不是很严格。另外，在报新药时，可同时写入申报资料，如标题是：检测限的测定；结果中写：最低检测量是xx ng，最低检测浓度是xx ug/ml。这样就不会因为概念出问题了。（我们就是这样做的）而最低检测量就是最低检测浓度乘以进样量，写明任一个结果均可。不会被认为是错误的。个人认为，审评人员看中的是你对问题的解决途径，就是说问题是否被很好解决了，对于结果的撰写形式，倒是很少那么较真吧。因为他自已也不能准确地定义，呵呵。我个人认为噪音峰不应该

11、计最大的，而应该以出现频率最多的信号计，如果以最大的噪音峰来计，检测限会偏 大的。我平时做检测限的时候通常是在做有关物质自身对照溶液线性的时候，选取浓度最低的样品稀释进样，我的经验是：这样做稀释的次数要少，且好计算。如果没有目的地一针一针的试，通常到最后就已经没有浓度的概念了。记得，我刚入行的时候，跟着老师做，检测限，她只告诉我做到S/N=3。然后，我就这么茫目的稀释，光那个检测限，我就做了大半天。现在想起来都觉得糗。检测限(limit of detection，LOD)当用仪器分析方法时，可用已知浓度的样品与空白试验对照，记录测得的被测药物信号强度S与噪音(或背景信号)强度N，以能达到SN2

12、或SN3时的样品最低药浓为LOD；也可通过多次空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差(即3空或3S空)作为检测限的估计值。定量限 (limit of quantitation，LOQ)将多次空白试验测得的背景响应的标准差(即空白标准差)乘以10，作为定量限的估计值，继之，再通过分析适当数量已知接近定量限或以定量限制备的样品来验证。八、PPM简单的说：1ppm=1mg/kg=1mg/L=110-6 常用来表示气体浓度，或者溶液浓度。 ppm是英文parts permillion的缩写，译意是每百万分中的一部分，即表示百万分之（几），或称百万分率。如1ppm即一百万千克的溶液中含有1千

13、克溶质。ppm与百分率（）所表示的内容一样，只是它的比例数比百分率大而已。 在花卉生产栽培中，常常施用“微肥”和“植物激素”，这些药剂在施用时，其用量甚微，每千升的容量中只含有几毫克甚至更少，故用“ppm”来表示。九、紫外扫描定检测波长方法一:波长扫描，找最大吸收不就行了，一般是扫描，取最大波长。办法二:如果测有关物质，一般选择254。如果测含量，一般选择最大吸收波长。方法三:一般的液相上具有二极管阵列检测器的,都可以进行波长扫描,以取得最大吸收峰,如果没有这种功能的,可以从254开始,每格5或10的波长进行增加寻找,可以比较麻烦,也是没办法的办法.当然了,最好要有纯物质,这样比较准确点.方法

14、选择问题:比如,流动相配制流速取样量波长溶剂选择,以及检测器的选择等,都是要考虑的问题.如果没有那种功能，可以用紫外扫描仪扫描，这样就可以找到最大吸收波做波长扫描是最简单的方法,如果不成,可以判断样品中的特定官能团,查相关文献,会有对此官能团的最大吸收波长,以其做参考,在其波长附近.做几个相差5或10nm的.一般不论实验是测含量还是有关物质,波长选择都先用流动相配制样品扫一张紫外图谱,初步确定最大吸收波长,以作参考.而真正选择哪个作为检测波长还需在液相上试.因为往往与紫外扫描有差异.影响因素很多,样品的浓度差异,液相上流动相有时是双泵混合而得与手动配制也有一定的差异.含量测定一般选用液相上待测

15、成分吸收最大的波长,因为此时灵敏度最大,误差相对小.但若1.其最大吸收波长是比较靠近200nm,由于溶剂截止波长的影响当然也可适当将波长往长波方向移;2.有时需同时测定多种成分,且最大吸收波长差异又较大,为兼顾也可选择中间波长.有关物质的波长选择因是检测有关物质且常常量小,一般是选用有关物质的最大吸收波长.同样也存在为方便同时检测多个有关物质而选用中间波长的情况.有关物质的情况比较复杂,在未知有关物质数目种类的条件下最好能用二极管阵列检测器,以防止在某些波长下,有些又不容忽略的有关物质不被显示而漏检.总之,二极管阵列检测器的用处比较大,我也是用后深有体会.波长选择百变不离其中的是应符合方法学上的要求. 我们初步选定最大吸收波长的方法：先按药典两种药物项下用甲醇作溶剂，然后用原料配制混合的对照溶液，用对照容易在紫外光度计上从200-400进行全波长扫描（每隔10nm扫描一次）找出最大的吸收波长，然后用初步确定的最大吸收波长在液相上进行实验看峰的峰型如何，如果峰型不太好我们可以根据紫外扫描的结果进行适当的调整。