微生物酶活性试验方法(7页).doc

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1、-微生物酶活性试验方法-第 7 页微生物酶活性试验方法脱氢酶活性测定方法参考：【周春生, 尹军. 一 脱氢酶活性检测方法的研究J. 环境科学学报, 1996, 4: 400-405.】以及【环境工程微生物检验手册M. 中国环境科学出版社, 1990.】（一）试验方法：（1）水样预处理：取污泥混合液10ml，放入离心管中离心5min后去除上清液，用纯水反复清洗三次，最后向样品中加入纯水至10ml搅拌均匀。（2）加试剂：将处理后样品转移至25ml比色管中，依次加入7.5mlTris-HCl缓冲液（PH=8.4）、2.5ml硫酸钠溶液（0.36%）、2.5ml纯水以及2.5mlTTC溶液（0.4%）

2、、混匀。（3）样品培养：将比色管置于37条件下水浴恒温振荡器中培养，培养5min后吸取5ml于离心管内，加0.5ml甲醛固定以作样品空白；（4）终止酶反应：继续培养30min，然后向管中加入2ml甲醛终止酶反应；（5）样品萃取：将样品培养液以5.5ml为1份分装在四个离心管中，连同样品空白对照管一道离心5min, 弃去上清液向各离心管内加6ml丙酮, 研磨搅拌混合, 于37条件下萃取TF10min后；（6）比色分析：将萃取液进行离心5min,用1cm的比色皿取上清液显色液, 于波长485nm处进行比色, 记录吸光值,根据样品显色液与样品空白的吸光值之差, 查标准曲线, 进而计算出TF的生成速度

3、, 即脱氢酶活性(mg/(L*h)（二）试剂：（1）0.4三苯基四氮唑氯化物溶液（氯化三苯基四氮唑，TTC）:4g-2、3、5-氯化三苯基四氮唑，稀释至1L至容量瓶中，棕色瓶保存；（2）Tris-HCl缓冲液：称取6.057gTris（三羟甲基氨基甲烷, 分析纯, 北京化学试剂厂），加入20ml 1mol/L HCl溶液, 再定容至1L；（3）硫酸钠溶液（0.36%）：3.6g硫酸钠（Na2SO3）稀释至1L容量瓶中；（4）TTC标准溶液：称取0.05gTTC定容与50ml茶色容量瓶中此溶液即为1mg/L的标准溶液。（三）标准曲线的绘制：（1）采用1mg/L的TTC标准溶液制备每含20、40、

4、60、80、100、120、140gTTC系列溶液，即取1、2、3、4、5、6、7ml至50ml容量瓶中，稀释至50ml进行实验；（2）用8试管，分别加入2ml Tris-HCl缓冲液、2ml纯水、2ml不同浓度的TTC，第八只不加入TTC；（3）加入10g硫酸钠溶液，TTC被还原为红色的TF；（4）加入5ml丙酮振荡摇匀提取TF（振荡床振荡10次）；（5）离心5min后485nm下测吸光度；（6）吸光度为纵坐标，TTC浓度为横坐标绘制标准曲线。（四）计算：TF=A*B*CA：标准曲线上读数；B：计算时间矫正值：培养时间/60min；C分光时的稀释倍数，当分光0,8时，稀释分光ATP含量测定方

5、法参考：【环境工程微生物检验手册M. 中国环境科学出版社, 1990.】ATP消化后变为无机磷，制备ATP消化液，测无机磷吸光度以确定ATP含量（一）试验方法：（1）活性污泥稀释1:20，曝气池稀释1:10（保证ATP量在0.1-1.0mg/L之间）；（2）用50ml烧杯加入35ml 的（pH=7.75 0.025M Tris缓冲液）加热至沸腾；然后加入待测活性污泥溶液1ml，煮沸加热30-60s后摇动几分钟放入冰浴中，冷却后加入pH7.75 0.025M的Tris缓冲液至50ml，摇匀过滤，所得过滤液供测ATP；（3）ATP制备液消化：去待测液1ml于比色管中，加入2.5ml10N硫酸，至于

6、高压锅中加压128,15min，冷却后加入1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；（4）取两支试管，加入消化液3ml，摇匀，另一只加入纯水3ml，各加入定磷试剂3ml，至于45水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；（5）用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，利用无机磷含量查Pi-ATP相关曲线，得出ATP值；ATP含量高的污泥，微生物活性越高。（二）试剂：（1）无机磷溶液中间液：烘干后称取0.2195g KH2PO4稀释至500ml容量品；（2）无机磷溶液使用液：上述溶液取10ml稀释至100ml；（3）定磷试剂：6mol/L硫酸：水：2.5%钼酸铵：10

7、%抗坏血酸（体积比）=1：2:1:1，配置时按上述顺序加入试剂。溶液配制后当天使用，正常为浅黄绿色，若颜色不正常，则不能使用6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸加入83ml水中，得6mol/L；2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵100ml容量瓶；10%抗坏血酸：取10g抗坏血酸100ml容量瓶（棕色瓶冷藏）。（4）ATP：10mgATP（5）pH7.75 0.025M的Tris缓冲液： 3.02785g稀释至500ml+35ml 1mol/L盐酸1000ml容量瓶（6）10N硫酸：271.7ml浓硫酸加入700ml纯水中，冷却后，稀释至1000ml容量瓶中；（三）标准曲线的绘制：1、无机磷标准曲线的

8、绘制（1）取KH2PO4置于烘箱中恒重后称取0.2195g，稀释至500ml容量瓶中，得无机磷浓度100ug/L；（2）取10ml上述溶液稀释至100ml容量瓶中定容，得无机磷浓度10ug/L，取6之试管；试管无机磷纯水无机磷浓度加定磷试剂1030320.22.82330.42.64340.62.46350.82.28361.02.0103（3）将试管置于45中水浴，保温25min，冷却后660nm下比色；（4）以吸光度作为纵坐标，无机磷含量为横坐标，绘制标准曲线；2、ATP-无机磷曲线绘制；（1）称取10mgATP，取少量新配的pH7.75 0.025M的Tris缓冲液，充分摇匀溶解，定容至

9、1L,最终浓度为10mg/L；取上清液，配置从1.00-0.01mg/L系列标准液；（2）ATP标准液的消化：去待测液1ml于比色管中，加入2.5ml10N硫酸，至于高压锅中加压128,15min，冷却后加入1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；（3）取两支试管，加入消化液3ml，摇匀，另一只加入纯水3ml，各加入定磷试剂3ml，至于45水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；（4）以吸光度为纵坐标，ATP浓度为横坐标，绘制曲线；（5）用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，然后作为纵坐标，ATP为横坐标，绘制Pi-ATP相关曲线。脲酶活性测定方法参考：【李

10、振高, 骆永明, 滕应. 土壤与环境微生物研究法M. 科学出版社, 2008.】 根据脲酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。（一）试验方法：（1）水样预处理：取10ml待测样品经甲苯处理后，加510滴甲苯，盖好；（2）加试剂：15min后加10ml 10%尿素和20ml pH=6.7柠檬酸盐缓冲液（3）样品培养：将锥形瓶置于37条件下恒温箱，培养24h过滤；（4）继续加试剂：取滤液1-3mg/L（视样品浓度定）与50ml比色管中，加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀；（5）比色分析：20min后定容，并在578nm波长下分光；（6）计算：并在标准曲线上

11、求氨氮的量，测出脲酶活性。每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差？。还需减去无土基质（尿素柠檬酸盐）。（二）试剂：（1）甲苯（分析纯）；（2）10%尿素：尿素（分析纯）10克溶于100毫升蒸馏水中，（现配现用）；（3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至6.7，并用水稀释至2L；（4）苯酚钠溶液：A液：62.5苯酚溶于少量95%乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升。B液.27克氢氧化钠溶于100毫升水中。将二溶液保存在冰箱里。使用前，将溶液A、B各吸取2

12、0毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升；（5）次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。（6）标准溶液：称0.4717克硫酸铵（105烘干）溶于水，稀释至1升（1毫升含100微克氮）即100ppm。（三）标准曲线的绘制：（1）将100ppm的标准溶液稀释为10ppm，分别吸取0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml于50毫升容量瓶或刻度试管中，加蒸馏水至20ml；（2）再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀，20min后显色，定容，使溶液浓度为：0.1ppm、0.3ppm、0.5p

13、pm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。（3）1h内在分光光度计上与波长578nm处比色，绘制标准曲线。（四）计算：脲酶活性以24h内每克土中氨态氮的毫克数来表示。NH3-N（mg/1g土24h）=（土样浓度稀释倍数比色体积）（1000干土重）1000：1000为ug换算成mg 土样浓度：标准曲线查得浓度硝酸还原酶活性测定方法参考：【李振高, 骆永明, 滕应. 土壤与环境微生物研究法M. 科学出版社, 2008.】 原理：在厌氧条件下，通过样品与酚二磺酸的显色反应计算出反应前后硝态氮的含量差值，从而计算出硝酸还原酶的活性。（一）试验方法：取10ml待测样品与

14、50ml三角瓶中，加入葡萄糖，硝酸钾溶液，在真空下培养24h后，利用酚二磺酸分光光度计测定反应前后硝酸盐的含量差值，最后计算出硝酸还原酶活性（二）试剂：亚硝酸还原酶活性测定方法参考：【李振高, 骆永明, 滕应. 土壤与环境微生物研究法M. 科学出版社, 2008.】 原理：通过亚硝态氮与格里试剂反应所产生的颜色深度，测定酶促反应前后亚硝态氮的变化，从而得出亚硝酸还原酶的活性。（一）试验方法：取50ml待测样品与50ml三角瓶中，加入葡萄糖，亚硝酸钠溶液，在真空下培养24h后，加入格里试剂显色，最后再波长550nm处测定反应前后的样品吸光度值，其差值可表示亚硝酸还原酶活性硝化速率的测定方法硝化强

15、度的试验方法（一）试验方法：（1）150ml三角瓶中盛30ml硝酸细菌培养基，灭菌；（2）培养：冷却，接种1ml活性污泥溶液，于28培养15天，取出过滤。滤液装于塑料瓶中，低温保存（4度以下，最好马上测下步）。用比色法测定虑液中的亚硝酸含量。（3）加试剂：取滤液1ml（取决于虑液中亚硝酸量）于50ml容量瓶中，定容。再取1ml定溶液于50ml比色管中，稀释至约40ml，加入1ml对氨基本磺酸试剂，放置10分钟，然后加入1ml 萘胺试剂、1ml20醋酸钠，定容，呈色10分钟后，用分光光度计（波长520nm）比色测定。（潮土亚硝酸含量较少，可在第一步就就加显色剂，定容测定。）（4）标准曲线的绘制：

16、同时吸取亚硝酸根溶液（每毫升含NO-20.01毫克）0.5、1、2、3、4、5ml，分别放入50ml比色管中，即得0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg亚硝酸根，与待测标本同样条件进行比色，根据标准系列得透光度绘制标准曲线，查出待测标本中亚硝酸根毫克数。（5）与此同时，用同一方法测定原始培养液中亚硝酸根含量（二）试剂：（1）硝酸细菌培养基： NaNO2 1.0克MgSO47 H2O 0.03克K2HPO4 0.75克 MnSO44 H2O 0.01克NaH2PO4 0.25克蒸馏水 1000 毫升Na2CO3 1.0克（2）格利斯氏试剂：（a）对氨基苯磺酸试剂：溶解0

17、.6g对氨基苯磺酸于70ml沸蒸馏水中，冷却后加入20ml浓盐酸，然后稀释成100ml，贮于棕色瓶中，保存于冷处备用。（b）萘胺试剂：溶解0.6g萘胺于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，然后稀释至100ml，贮于棕色瓶中，保存于冷处备用。（3）20醋酸钠（三）标准曲线的绘制：亚硝酸根标准溶液：称取1.500g分析纯亚硝酸钠于烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入1000ml量瓶中，再加蒸馏水至刻度，摇匀。此溶液中亚硝酸根浓度为1000ppm（即1ml含亚硝酸根1mg）。用时以此液配成稀的亚硝酸根标准溶液（每毫升含NO-20.01mg）。（四）计算：（1）NO-2N毫克数/30毫升活性污泥ppm比色体积稀释倍数10-3 式中ppm由标准曲线查知； 10-3换算为毫克。（2）根据下式计算活性污泥硝化作用强度：硝化作用原始培养基中NO-2量-培养后培养基中NO-2量100/原始培养基中NO-2量原始培养基中NO-2量：1g/L