病毒的分离鉴定(8页).doc
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1、-病毒的分离鉴定-第 8 页病毒的分离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起,则必须满足以下原则:从患病者体内分离出病毒;在实验动物或寄主细胞中可以培养;证明这种培养物具有滤过性;在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症;能重新分离出病毒。1. 病毒的分离1.1 标本的处理1标本的收集a) 粪便标本:将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中,搅拌成悬液,倒出上清,3000g,4离心6min。b) 拭子和生物体液:拭子浸在2-3ml运载培养基中,将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本,如果液体被污染,应3000g 4离心30min。c) 组织标本:用无菌乳
2、钵或匀浆器研磨组织标本,同时加入足量的PBS制备成20%的悬液,3000g 4离心30min。1.1.2 除菌处理a) 粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升,置4过夜。b) 鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升,置4作用4小时。c) 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等,则可加入等量的乙醚4过夜除菌。1.2 病毒的分离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物,培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物(动物接种)、鸡胚(鸡胚接种)或离体细胞进行分离培养(细胞培养)。1 鸡胚接种a) 鸡卵的选择:一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上
3、的一致 。b) 孵育:孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上,孵育的最适温度为38-39,相对湿度为4070,孵育8日后,鸡卵应每天翻动12次,以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。c) 检卵:鸡卵孵育45天后,即可用检卵器检查鸡胚发育情况(二天一次)。未受精鸡卵:在检卵器上仅见到模糊的阴影。活鸡卵:鸡胚发育4天后,在检卵器上就可见到清晰的血管,鸡卵内有一小黑点(鸡胚),有明显的自然转动。死胎:如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动,则可判断胚胎频死或已经死亡,应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后,用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。d) 接种:图2. 鸡胚羊膜腔接种:用1214天鸡
4、胚,将检材注入羊膜腔,孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的初次分离。图1. 鸡胚卵黄囊接种:用58天鸡胚,以细长针头由鸡卵气室端刺入卵黄囊。孵育后取获卵黄囊膜检查。常用于某些嗜神经病毒的分离。图3. 尿囊腔接种 用912天鸡胚,将标本接种于尿囊腔, 孵育后取尿囊液检查, 常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等。图4. 绒毛尿囊膜接种:用10l 2天鸡胚,以无菌手续在蛋壳上开小窗,然后将材料滴在绒毛尿囊膜上孵育后。观察膜上有无斑点病变。常用于培养单纯疱疹病毒、天花病毒和痘病毒。e) 剖检及收获收获前鸡胚应置4冰箱过夜,使鸡胚内血液凝固。收获时,用碘酒将气室部卵壳消毒,将气室处卵壳剥去(不要将碎片落入壳膜
5、)。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压,(切勿压破卵黄囊)再用吸管吸取尿囊液,置青霉素小瓶内,于低温保存。f) 优缺点优点:技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大、不需特殊设备。缺点:很多病毒不能适应,主要是哺乳动物的病毒。 细胞培养细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬液进行培养。根据细胞的类型和培养细胞代数的不同,可将其分为两种:原代细胞培养;传代细胞培养。组织细胞培养的病毒,当出现稳定的细胞病变后,就可取培养液或培养液与细胞培养物混和物,细胞培养物中的病毒可采用冻融、超声波等方法使其释放出来。 优点:a) 每个细胞
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