2022年免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结版本.docx

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1、精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -资料收集于网络,如有侵权请联系网站删除免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1 、方法操作不难,最大的难处是显现反常结果时如何解决？这就需要把握免疫组化试验原理, 每一步知道为什么这样做,这样你才敢大胆的改革从前的不对的方法步骤.如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间,这三者一般是相互成反比的（相对）,其中浓度是最重要的先决条件,温度打算反应的速度、时间打算反应的量.就拿温度来说,可以有4度、室温、 37 度,我举荐 4 度正确,反应最温顺,背景较浅.而 37 度反应速度较快,时间较短. 室

2、温我不太提倡, 除非你每次都把环境温度掌握在肯定的范畴, 否就,尽量挑选前两者.2、免疫组化最大的优势是定位和定性.相比于其他蛋白检测方法,免疫组化具有 定性灵敏度高、 定位较直接精确,是定位检测分析首选方法.特殊对于有些因子的转位讨论特别有用.3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片.免疫组化结果也能定量分析,但必需是背景染色浅而特异性染色较深的情形下,分析最为精确, 这种原就可能也是我们日常审稿时判定讨论结果的必备条件.4、免疫组化试验肯定要设置阳性对比和阴性对比.阳性对比一般是用确定表达这 种抗原的切片来做. 阴性对比一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应,其余步骤均一样.前者

3、是排除方法和试验系统有无问题.后者是排除有无一抗外的非特异性染色.5、免疫组化的应用广泛,是当前试验讨论的最重要方法之一.如今发 SCI 论文时,明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难,加一些形状学数据或图片,老外特别欢迎, 可能是怕你学术造假吧.当然也不能做假阳性或假阴性结果.6、免疫组化技术把握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片.我在平常带教中就发觉很多讨论生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤, 重复运用于同一性质的切片和同一种抗体,做出来后就觉得自己已经把握了免疫组化方法,更换一种抗体后,竟然连二抗的种属来源都拿错了.失败往往促进你去

4、摸索试验原理和过程,胜利有时也加快你自傲.7、试验方法需要动手+动脑 .如今我仍不敢说我在免疫组化什么都知道.我只所以今日敢在这里说这说那,这是由于我经过了反复的动手+动脑,把理论原理运用于实践,在 把实践中发觉的问题带到理论学问中去解决,最终把理论与实践融会贯穿.一、概念和常用方法介绍1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量讨论,这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术.2、原理 依据抗原抗体反应和化学显色原理,组织切片或细胞标本中的

5、抗原先和一抗结合, 再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应,前者再用标记辣根过氧化物酶（ HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合,最终通过呈色反应 或荧光来显示细胞或组织中化学成分,在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰观察细胞内发生 的抗原抗体反应产物, 从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量.3、分类1 ）按标记物质的种类,如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等,可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶 标法和免疫金银法等.2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）.与直

6、接法相比,间接法的灵敏度提高了很多.3）按结合方式可分为抗原-抗体结合,如过氧化物酶- 抗过氧化物酶（PAP）法.亲和连接,如卵白素- 生物素 - 过氧化物酶复合物（ ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白- 过氧化物酶连结（SP）法等,其中SP法是比较word 可编辑可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 1 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -资料收集于网络,如有侵权请联系网站删除常用的方法

7、. 聚合物链接, 如即用型二步法,此方法特殊适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测.4、目前几种常用免疫组化方法简洁介绍1 ）免疫荧光方法是最早建立的免疫 组织化学技术. 它利用抗原抗体特异性结合的原理,先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观看.当抗原抗体复合物中的荧光素受激 发光的照耀后即会发出肯定波长的荧光,从而可确定组织中某种抗原的定位,进而仍可进行定量分析.由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便,所以在临床病理诊断、检验中应用较广.2）免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后,于 60 岁月进展起来的技术.基本原理是先以酶标记的抗体与组织或

8、细胞作用,然后加入酶的底物,生成有色的不溶性产物或具有肯定 电子密度的颗粒,通过光镜或电镜,对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位讨论.免疫酶标技术是目前最常用的技术.本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位精确, 对比度好,染色标本可长期储存,适合于光、电镜讨论等.免疫酶标方法的进展特别快速,已经衍生出了多种标记方法,且随着方法的不断改进和创新,其特异性和灵敏度都在不断提高,使用也越来越便利.目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、 SP 三步法、即用型二步法检测系统等. 3）免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物.胶体金是指金的水溶胶,它能快速而稳固的吸附

9、蛋白,对蛋白的生物学活性就没有明显的影响.因此,用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子 如葡萄球菌A 蛋白 等作为探针,就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位,甚至定量讨论.由于胶体金有不 同大小的颗粒, 且胶体金的电子密度高,所以免疫胶体金技术特殊适合于免疫电镜的单标记或多标记定位讨论.由于胶体金本身呈淡至深红色,因此也适合进行光镜观看.如应用银加强的免疫金银法就更便于光镜观看.5、被检测的物质组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原,如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测.6、特点1 ）特异性强.免疫学的基本原理打算抗原

10、与抗体之间的结合具有高度特异性,因此, 免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示,如角蛋白（ keratin）显示上皮成分,LCA显示淋巴细胞成分.只有当组织细胞中存在交叉抗原时,才会显现交叉反应. 2）敏锐性高.在应用免疫组化的起始阶段,由于技术上的限制,只有直接法、间接法等敏锐性不高的技术,那时的抗体只能稀释几倍、几十倍.现在由于ABC法或 SP三步法的显现, 使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合,这样高敏锐性的抗体抗原反应,使免疫组化方法越来越便利的应用于常规病理诊断工作.3）定位精确、形状与功能相结合.该技术通过抗原抗体反应及呈色反应,可在组织和细胞中进行

11、抗原的准 确定位, 因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观看,这样就可以进行形状与 功能相结合的讨论,对病理学领域开展深化讨论是特别有意义的.7、从蛋白水平检测角度,免疫组化技术与Western blotting、ELISA 的异同 1） Western blotting：蛋白质免疫印迹,也是利用抗体抗原反应原理,结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法.与免疫组化技术相比,定量可能更加精确.当然 Western blotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量,进而间接反映它们的定位）,但敏锐性远远低于免疫组化技术.2）ELIS

12、A：酶联免疫吸附试验, 也是利用抗体 - 抗原 - 抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测.与免疫组化技术相比,定量最精确,是分泌性蛋白检测首选方法之一.二、试验流程简介word 可编辑可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 2 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -资料收集于网络,如有侵权请联系网站删除1、 SP三步法1）石蜡切片,常规脱蜡至水.2） 0.3%或 3%H2O

13、2去离子水（无色液体）孵育10-30 分钟,以灭活内源性过氧化物酶活性. 3）蒸馏水冲洗, PBS浸泡 5 分钟 4）候选步骤：采纳抗原修复：微波（建议 30 分钟内 4 次中火）、高压、酶修复方法.自然冷却,再用3 分钟 3 次. 5）血清封闭：室温 15-30 分钟, 尽可能与二抗来源一样.倾去, 勿洗. 6 ）滴加适当比例稀释的一抗,37 孵育 23 小时或 4过夜（最好复温）.PBS冲洗, 3 分钟 5 次. 7）滴加生物素标记的二 抗,室温或37孵育 30 分钟 -1h .8） PBS冲洗, 3 分钟 5 次. 9）滴加 SP（链霉亲和素- 过氧化物酶）,室温或37孵育 30 分钟

14、-1h . 10） PBS冲洗, 3 分钟 5 次. 11）显色剂显色（ DAB等）. 12）自来水充分冲洗.13）可进行复染,脱水,透亮.14）挑选适当的封片剂封片.2、即用型二步法1 ）脱蜡、水化组织切片.2）依据所应用的一抗的特殊要求, 对组织切片进行预处理.3） 0.3%或 3%H2O2去离子水孵育5 分钟 -30 分钟,以阻断内源性过 氧化物酶, PBS或 TBS冲洗. 4）滴加一抗,室温或37孵育 3060 分钟,或4过夜, PBS或 TBS浸洗 3 分钟 5 次. 5）滴加 enhangcer 增强剂, 37 度 30min,PBS或 TBS浸洗 3 分钟5 次. 6）滴加通用型

15、IgG 抗体 -Fab 段-HRP 多聚体,室温 /37 孵育 30 分钟 -1h ,PBS/TBS冲洗, 3 分钟 5 次. 7）应用 DAB溶液显色. 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透亮、封片.三、免疫荧光技术1、免疫荧光方法中的重要环节1 ）冰冻切片制备：建议用新奇组织,否就组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散. 选用洁净锐利的刀片、组织肯定要冷冻适度等,防止裂片和脱片严峻.2）组织切片固定：切好片风干后立刻用冰西奈山环保组织固定液固定5-10min ,特殊要较长时间储存的白片,肯定要准时固定和适当储存.3）血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一

16、样）封闭,减弱背景着色.血清封闭的时间是可以调整的,一般10-30min .4）一抗孵育条件：在免疫组 化反应中最重要,包括孵育时间和抗体浓度.一抗孵育温度有几种：4 度、室温、 37 度,其中 4 度成效正确.孵育时间：这与温度、抗体浓度有关,一般37 度 1-2h ,而 4 度过夜和从冰箱拿出后37 度复温 45min .详细条件仍要摸索.5）二抗孵育条件：二抗一般室温或37度 30min-1h ,详细时间需要摸索,而浓度一般有工作液,如是浓缩液仍要摸索浓度,切记要避光反应. 但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间. 最终, 荧光素标记的二抗随着储

17、存时间的延长,可能后有大量的游离荧光素残留,需要留意配制时小包装和并进行适当的离心.6）复染：目的是形成细胞轮廓,从而 更好的对目标蛋白进行定位.一般常用DAPI 复染. 7）封片：为了长期储存,我们一般用缓 冲甘油等封片, 此外仍有特的的抗荧光萃灭封片液.防止产愤怒泡, 方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止.当发觉液体接触面在不断弥散时,就可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产愤怒泡.8）切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当的加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要

18、,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3 次,而一抗孵育后的清洗均为5 次*5min .留意（ 1）单独冲洗,防止交叉反应造成污染.（2）温顺冲洗,防止切片的脱落.我喜爱用浸洗方式.（3）冲洗的时间要足够,才能完全洗去结合的物质.（4）PBS的 PH和离子强度的使用和要求.这方面 我有惨痛教训,当时我买的抗体稀释液偏酸,结果背景一片黄（未见特异性染色）,建议PH在 7.4-7.6浓度是 0.01M.（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成,而酸性条件就有利于分解.低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度就有利于分解） 9）拍照：有条件的话最好立刻拍照,如不能准时拍照,也要封

19、好片和用指甲油封固,保持避光和湿度. 使用荧光显微镜留意严格依据荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随便word 可编辑可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 3 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -资料收集于网络,如有侵权请联系网站删除转变程序. 应在暗室中进行检查.防止紫外线对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜.检查时间每次以12h 为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐步

20、下降,荧光减弱.标本 受紫外线照耀35min 后,荧光也明显减弱或褪色.激发光长时间的照耀,会发生荧光的衰减和淬灭现象.所以最多不得超过23h.荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节约时间,爱护光源.天热时,应加电扇散热降温,新换灯泡应从开头就记录使用时间.灯熄灭后欲再启用时, 须待灯光充分冷却后才能点燃. 一天中应防止数次点燃光源. 关闭汞灯至少在开启 15-30 分钟后. 标本染色后立刻观看, 因时间久了荧光会逐步减弱. 如将标本放在聚乙烯塑料袋中 4储存,可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发.使用的玻片等载体,都必需厚度匀称,无明显的自发荧光,假如使用油镜,仍必需保证镜油为无荧光镜油

21、.电源最好装稳压器,否就电压不稳不仅会降低汞灯的寿命,也会影响镜检的成效.已有的常见免疫组化难题集锦1、石蜡切片和冰冻切片的比较？（ 1）要求做冰冻切片的不肯定能做石蜡切片, 这是今日我向一老师请教得出的结论.由于作石蜡切片时要高温烤片,可能会破坏组织的抗原性,假如组织的抗原性较稳固,就可作石蜡切片. 但是要求做石蜡切片的,可作冰冻切片.（2）冰冻切片的优点是能够较好的储存组织的抗原免疫活性,做免疫组化时不需抗原修复这一步. 缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构,可能会使抗原弥散.切片厚度较石蜡的厚,做的片子没石蜡的美丽.当你买一抗时,目录上都写着做什么样的切片,假如它写着只 能做冰冻,就不能

22、做石蜡,如写着两者都可,那就都能做.（3）石蜡切片的优点可以保持 组织细胞的形状结构,且简洁存放在室温,而冰冻切片比较麻烦,肯定要存在-80 度的低温冰箱中,特殊是用来做原位杂交的的切片,为了防止RNA降解,储存一贯很重要.由于石蜡切片可以切到4 微米左右, 所以原位杂交探针简洁渗透到组织中去,简洁胜利, 而且得到的颜色 / 形状都较冰冻切片好.2、一抗的挑选要点和技巧是什么？（1）单克隆和多克隆抗体的挑选.由一种 克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体.单克隆抗体能目标明确的与单一的特异抗原打算簇结合, 就像导弹精确的命中目标一样.另一方面,即使是同一个抗原打算簇,在机体内也可以由好几种克隆来产

23、生抗体,形成好几种单克隆抗体混杂物,称为多克隆抗体.在抗原抗体反应中,一般单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对就低.而多克隆抗体特异性稍弱,但抗体的亲和力强,灵敏度高,但易显现非特异性染色（可以通过封闭等 防止）.（ 2）应用范畴的挑选.有的一抗只能用于Western blotting,或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等.甚至说明石蜡切片或冰冻切片.（3）种属反应性的挑选（species reactivity）.这一点很重要,说明这种抗体可能存在种属差异,且这种抗体适合检测哪种 种属动物体内的抗原.4 种属来源, 一般兔来源的多是多克隆.而小鼠来源的多是单克隆,但也有另外.依据

24、此来源来挑选相应的二抗.5 生产厂家的挑选.如santa Cruz 公司抗体一般 1ml ,价格 2100 元左右.而chemicon 公司一抗一般100ul ,价格 2800 元左右. 这两个厂家的同一种抗体它的实际效价稳固是不同的,我一般用后者抗体做免疫组化成效较好,而前者做 Western blotting成效仍可以.3、在什么情形下使用TritonX-100？（ 1） Triton X-100化学名称为聚乙二醇 辛基苯基醚,是一种去污剂.在免疫组织化学10um 厚切片 和免疫细胞化学中一般用 Triton X-100作为细胞通透剂,在膜上打孔.（2）其作用原理：Triton X-100

25、可以溶解细胞膜、 细胞核膜、 细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内,故在细胞免疫组化时尤为举荐使用,这样抗体就能顺当进入胞内与相应抗原结合.（ 3TritonX-100 既是一种表面活性剂,也有抗氧化作用,详细参阅：word 可编辑可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 4 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -资料收集于网络,如有侵权请联系网站删除4、封闭血清的挑选

26、原就是什么？（ 1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异 性吸附抗体,造成后续结果的假阳性；（ 2）封闭血清一般是和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体, 预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合,否就在后面的步骤中假如和二抗发生结合,会造成背景.（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能与一抗来源一样.5、抗体孵育条件的比较？（ 1）一抗孵育温度有几种：4 度、室温、 37 度,其中4 度成效正确.孵育时间：这与温度、抗体浓度有关,一般37 度 1-2h ,而 4 度过夜和从冰箱拿出后37 度复温 45min .（ 2）二抗一般室温或37 度 30min-1h ,详细时间需要摸索.6、一抗

27、 4 度孵育后为什么要进行37 度复温？（ 1）一方面,防止切片从4 度直接放入 PBS易脱片.（ 2）另一方面,使抗原抗体结合更稳固.一般不需要, 但对表达较弱的抗原可能有用,4 度和 37 度时分子运动方式不同, 前者分子碰撞机率和运动速度小于后者, 后者结合更快 , 但敏锐性也提高了并易造成非特异染色.（3）其实,我更赞同后一种说法, 由于我尝试把肝脏或睾丸片子从4 度过夜拿出后, 直接用 PBS洗没发生过脱片现象.事实胜于雄辩；7、 DAB显色时间如何把握？（ 1） DAB显色时间不是固定的,主要由显微镜下控 制显色时间,到显现浅棕色本底时即可冲洗.（ 2） DAB显色时间很短（如几秒

28、或几十秒）就显现很深的棕褐色,这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间.（ 3）此外,如很短时间就显现背景很深,仍有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间.（ 4）DAB显色时间很长 （如超过十几分钟） 才显现阳性染色, 一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4 度过夜） .另一方面就是封闭时间过长.8、免疫组化结果如何分析？（1）阳性着色细胞计数法.在40* 光镜下,随机挑选不重叠的10 个视野,人工或机器计数阳性着色细胞,每组36 张不同动物组织切片,然后进行组间比较即可.（2）灰密度分析法.通过在不同组别和不同动物

29、组织切片上挑选相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析,然后进行统计分析即可.（3）评分法.通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（03 分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深 褐色）、阳性范畴进行评分（14 分为 025%、2650%、5175%、76100%）,最终可以分数相加,再进行比较.对于以上这几种方法,各有利弊,请细心挑选.要想得到正确结果的前提是你要做出着色匀称、背景很浅的高质量切片.9、在什么情形下进行组织抗原修复,抗原修复的条件是什么？（ 1）由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中,发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用,从而失去抗原性.通过抗原修复,使得细胞内抗原

30、打算族重新暴露,提高抗原检测率.（2）修复方法从强到弱一般分为三种,高压修复、微波修复、胰酶修复.修复液也分为如干种（详细的可以查阅相关资料,大量的：中性的、高pH 的等）.（ 3）微波修复,我们一般用6min*4次,成效不错.10、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？（ 1）一般 3%过氧化氢灭活时 间短点, 可以 10min 左右. 而 0.3%过氧化氢就可以适当延长封闭时间,一般 1030min .（ 2）word 可编辑可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 5 页,共 8 页 - - - - - - - - -

31、 -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -资料收集于网络,如有侵权请联系网站删除用西奈山环保组织固定液配置过氧化氢比双蒸水或PBS能更好爱护抗原和固定组织作用,过氧化氢孵育时间过长易引起脱片.（3）现用现配,配好后4 度避光储存.11、如何才能充分脱蜡？（ 1）蜡不溶于水,假如脱蜡不洁净,少许蜡存留于切片上,将会引起染色不匀称、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等.为明白决上述 的问题,切片在染色前必需完全脱蜡,目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯,因它脱蜡力强, 脱蜡时间较短.（ 2）脱蜡的时间要依据季节,室温

32、顺试剂的新奇谋面是在不同.假如在夏天,室温较高,脱蜡试剂也新奇,就脱蜡时间不需很多,3-5 分钟就已足够.假如在冬天, 室温较低,脱蜡试剂也较陈旧,就脱蜡时间需要延长,10-20 分钟或更长.（3）当天切的切片, 烧烤 2 小时后进行染色,切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程,假如预先切好烤好的切片, 在染色前,仍必需对切片进行加温10-20 分钟, 然后再行脱蜡,这样脱蜡速 度加快, 成效魁伟更好. 总之, 操作时应依据不同的季节,不同的室温, 不同的试剂来打算,脱蜡的时间,原就上是要完全、洁净、完全的脱去切片上的蜡.12、如何最大限度 的降低组织非特异性染色？（ 1）缩短一抗 / 二抗

33、孵育时间、 稀释抗体来掌握.这是最重要 的一条. （2）一抗用多克隆抗体易显现非特异性着色,建议试用单克隆抗体看看.（ 3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织）,需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色.（ 4）非特异性组分与抗体结合,这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭成效.（ 5）缩短 DAB孵育时间或降低DAB浓度 / 过氧化氢浓度等.（6）适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间,在 一抗、二抗或SP 孵育之后的浸洗尤为重要.（7）防止标本染色过程中显现干片,这简洁增强非特异性着色.13、苏木素复染时间的把握？（ 1）

34、苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情形,一般数秒- 数分钟.不过这个假如染色不抱负可以补救的.即：染色深就分化时间稍长些即可.染色浅就再置于苏木素中染色即可.（ 2）盐酸酒精是分化,氨水是返兰. 作用不同. 片子复染完后流水振洗,然后置于盐酸酒精中数秒（肯定动作要快）后拿出流水振洗,在放入氨水中返兰即可.（3）假如分化的颜色过浅,可以复置于苏木素中染色.14、PBS的清洗方式挑选、次数和时间的挑选？（1）单独冲洗,防止交叉反应 造成污染.临床上每天检测的病例很多,所用的抗体种类及项目也多,假如在加入一抗孵育完后,将它们在一个缸内洗,这样就会造成交叉污染,影响最终的结果.

35、正确的做法是单独的进行冲洗,冲洗的PBS为一次性,保证切片没有相互交叉污染的机会.（ 2）温顺冲洗,防止切片的脱落.冲洗切片,取出切片,将PBS从上轻轻的冲洗,让PBS自上而下流下来, 不要拿起切片将PBS对准切片冲洗, 这样由于冲出的PBS有肯定的冲击力, 很简洁使切片周边引起松动,导致切片的脱落.（3）冲洗的时间要足够,才能完全洗去结合的物质.冲洗切片有人提出用微振荡器振染,振下未结合的各种物,使之不产生背景,此种做法一是铺张时间, 二是很简洁导致切片的脱落.切片的冲洗据实践认为,用一小烧杯柔和的于切片上冲 洗,就能完全冲洗去未结合的物质,无需附加其它条件,冲洗好于切片上再注入PBS,连续

36、2 分钟左右就完全足够了.（4） PBS的 PH和离子强度的使用和要求.刘彦仿指出：中性及word 可编辑可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 6 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -资料收集于网络,如有侵权请联系网站删除弱硷性条件 （PH7 8）有利于免疫复合物的形成,而酸性条件就有利于分解.低离子强度有 利于免疫复合物的形成,而高离子强度就有利于分解.免疫组化PBS我们目前常用的P

37、BS 的 PH 在 7.4-7.6浓度是 0.01M,依据本室十几年来的使用情形,认为该溶液价格廉价配制方面,使用成效好.（5）常用试剂的配制和使用.在免疫组织化学的染色过程中,用得最多的试剂就是缓冲液,由于切片在整个染色中,抗体的加、换、切片的冲洗, DAB的配制都离不开缓冲液. 可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用, 缓冲液的过酸或偏碱, 都将影响染色的结果.15、脱片产生的缘由和如何防止脱片？（ 1）多聚赖氨酸玻片质量的问题.我原先是买的, 迈新按说也是不错的,可是都脱成什么样子了.后面补做其次批时用的病理科老师自己做的片子,要好一点.（2）组织切的不好,切片机的问题例如比较老的旧的机

38、器切 的厚或者不匀称,或者切片者手法不好等.（3）组织的问题,我用的组织癌症的很多,越是癌症组织有坏死之类越简洁脱.（ 4）没烤好,时间短温度不够之类.（ 5）操作的时候甩 的太猛了,有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩,用卫生纸从边缘上渐渐吸水.（6）修复的问题： 抗原修复的时候高压时间过长了,或者放进100 度的修复液时手法不好,咚的一声就丢进去了,这样超简洁脱片.此外,用EDTA修复比柠檬酸简洁脱片,但是你要用到EDTA 的时候也没方法,只有从另外的问题上着手.（7）此外,一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎, 用 PBS的时候尽量用泡的,不要冲.基本上把这些方面都留意到了,能改善的尽量改善

39、,脱片可以削减很多.16、背景染色较深的缘由有哪些？（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的 缘由之一. 解决方法是, 每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己试验室的抱负工作浓度,既使是即用型的抗体也应如此,不能只简洁的按说明书进行染色.（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决方法是,严格执行操作规程,最好随身佩带报时表或报时钟,准时提示,防止因遗忘而造成时间延长.现在流行的二步法（Polymer ）敏锐性很高,要求一抗孵育的时间不是传统的1 小时,而是 30 分钟,因此,要依据染色结果进行调整.（ 3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配,如有沉渣应进

40、行过滤后再用.配制好的DAB不应存放时间太长,由于在没有酶的情形下,过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力,未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这 种好像节约的方法是不行取的.DAB的显色最好在显微镜下监控,达到抱负的染色程度时立即终止反应. 不过当染色片太多时或用染色机时,这样做好像不现实,但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控,防止显色时间过长.（4）组织变干：修复液溢出后未准时补充液体、染色切片太多、动作太慢、遗忘滴液、滴液流失等都是造成组织变干的缘由.解决的方法是操作要认真认真,采纳DAKO笔或 PAP Pen 在组织四周画圈,可以有效的防止液体流失, 也能提

41、高操作速度.（ 5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于 24 小时） ：缘由上不清晰, 但现象存在. 有的试验室喜爱前一天将切片脱蜡至修复,其次天加抗体进行 免疫组化染色, 假如将装有切片和修复液的容器放在4oC冰箱过夜, 对结果无明显影响,假如放在室温,特殊是酷热的夏天,会显现背景着色,因此,不行存放时间太长.（6）一抗变质、 质量差的多克隆抗体：留意抗体的有效期,过期的抗体要麽不显色要麽背景着色.用新买抗体时最好设立阳性对比和用使用过的抗体作比较.word 可编辑可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 7 页,共

42、8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -资料收集于网络,如有侵权请联系网站删除17 、苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长.答：返蓝可以用碱性溶液（ PBS/Na2HPO4淡/氨水）或45 度温水、冷水蓝化均可.一般蓝化510 min.淡氨水有人用50ml 自来水三四滴的氢氧化铵word 可编辑可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 8 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载