溶菌酶的种类及其作用机理比较(7页).doc

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1、-溶菌酶的种类及其作用机理比较-第 6 页溶菌酶的种类及其作用机理比较摘要：溶菌酶是一类对细菌细胞壁有水解作用的无毒、无害的蛋白质。本文简单介绍了溶菌酶的结构、性质、来源及发展，并对各种不同种类的溶菌酶及其作用机理进行了比较综述。关键词：溶菌酶、作用机理、动物源溶菌酶、植物源溶菌酶、微生物源溶菌酶1 溶菌酶的结构及性质1溶菌酶（Lysozyme，EC.17）又称胞壁质酶或N一乙酸胞壁质聚糖水解酶。是一种葡萄糖苷酶，其化学性质稳定，干燥条件下在室温可长期保存， 其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末，无嗅，味甜，易溶于水。不溶于丙酮、 乙醚1 。Phillips等人1965年用X射线晶体结构分析

2、法阐明了溶菌酶的三维结构，溶菌酶分子近椭圆形，大小为4.5nm3.0nm3.0nm,其构象复杂-螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的片层结构，研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的，疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用，其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙，这是溶菌酶的活性部位。2 溶菌酶的来源及发展2溶菌酶广泛分布于自然界各种生物体中 。它的研究最早起源于Nicolle（1907）发表的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）溶解因子。1909年Laschtschenko指出，鸡蛋清的强抑菌作用是由于酶的作用。1922年，Fleming发现，人的鼻涕、唾液、眼泪

3、等也有强的溶菌活性并将其溶菌作用因子命名为溶菌酶lysozyme）。从此，便开始了对溶菌酶的研究，并不断有新的进展。1959-1963年，Salton等人通过大量研究弄清了溶菌酶是一种能够切断N-乙酰壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间-1，4糖甘键的酶。1967年，英国菲利普集团发表了对鸡蛋清溶菌酶-作用底物复合体X-射线衍射的研究，介绍了其触媒的结构，成为近代酶化学研究中重大的成果之一。1960年以后，有关微生物的溶菌酶的研究进展很快，溶菌酶已成为研究细胞壁结构的一种非常有力的工具酶，不仅有助于人们对细胞壁细微结构的认识，而且大大促进了对新的溶菌酶的开发研究。随着研究的不断深入，发现溶菌酶不仅有溶

4、解细菌细胞壁的种类，还有作用于真菌细胞壁的种类，同时对其作用机制也有了更进一步的了解。3 溶菌酶的种类及其各自的作用机理 1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在，根据来源不同，其作用机制也不同，将溶菌酶分为以下三类1。3.1 动物源溶菌酶 动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。鸡蛋清溶菌酶（HEWL）是目前研究和应用最鸡蛋清溶菌酶是动物源溶菌酶的典型代表，也是目前研究得最深最透的一类溶菌酶。在鸡蛋清中溶菌酶含量大约2%4% ，等电点在pH10.8左右，分子量为14000

5、，能溶解溶壁小球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰氏阳性细菌，对革兰氏阴性细菌无分解作用。溶菌机理相当复杂，其最适作用温度为50，化学性质很稳定，pH在1.211.3之间变化不会影响酶结构太大的改变，遇热该酶也很稳定。pH47的范围内，酶在100处理1min仍有近100%的活力，但在碱性环境条件下，酶稳定性较差。鸡蛋清溶菌酶由129个氨基酸组成，维持其稳定性的结构主要由4个二硫键、氢键及疏水键等1。以多种常见标准菌株、临床致病菌等作为检测指示菌，研究表明3：鸡蛋清溶菌酶能分解藤黄微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌 ,但对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）和大肠埃希菌等革兰氏阴性菌等无

6、分解作用，只有与其它物质（如: 甘氨酸等）混合作用才表现一定的杀菌效果。因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞质壁和磷酸质组成的，其中的主要成分胞质壁又是由杂多糖与多肽组成的糖蛋白，而这种杂多糖正是由N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基脱氧葡萄糖以-糖苷键连结的；而溶菌酶能水解N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的-糖苷键，使细胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽 ，导致细胞壁破裂，内容物逸出而使细菌溶解。另外革兰氏阳性菌由脂多糖、磷脂、糖脂组成的外膜覆盖，所以溶菌酶对它们作用较强。对金黄色葡萄球菌不起作用主要原因是金黄色葡萄球菌细胞壁的胞壁酸的第 6 位已被 O-乙酰化 ,并生成 6- O-二乙酰胞壁酸

7、,并且其细胞壁的四缩氨酸几乎全部通过戊氨基乙酸进行交联 ,从而形成高密度的网孔结构。另外Morrison4 等认为革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的脂多糖对蛋清溶菌酶有很强的亲和性 ,从而阻止溶菌酶的渗透 ,使蛋清溶菌酶不能分解革兰氏阴性菌。3.2 植物源溶菌酶 目前发现含溶菌酶的植物有近170种，目前，已经从木瓜、芜菁、无花果等植物体内分离得到溶菌酶。植物源溶菌酶分子量较大，约为24000-29000个单位。其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3。但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍左右。比较其理化性质，植物溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶有所不同, 如: 木瓜、无花果和橡胶溶菌酶

8、的相对分子质量分别为28、29、36; pI值分别为10.5、9.0、9.0; 最适pH 分别为4.5、4.6、5.0。而HEWL的相对分子质量、pI值和最适pH值分别为13.7、11.0和6.25。植物溶菌酶活性与HEWL也不相同:,以溶壁微球菌 为底物时, HEWL的活性高而植物溶菌酶活性低; 以N-乙酰葡萄糖胺多聚体和甲壳质为底物时, 植物溶菌酶活性高而HEWL低。以采用植物源溶菌酶-萝卜溶菌酶6为例，对一些革兰氏阳性菌（白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌）、革兰氏阴性菌（普通变形菌、大肠杆菌 、鼠伤寒沙门氏菌 、多杀巴斯德氏杆菌、雏白痢沙门氏菌 、产气杆菌）和真菌（酿酒酵母 、总状

9、毛霉 、黑根霉、黑曲霉 、青霉）以及植物病原菌的抑菌效果进行了研究。结果表明：萝卜溶菌酶对3种革兰氏阳性菌、6种革兰氏阴性菌、5种真菌以及6种植物菌都有一定得杀菌效果。与鸡蛋清溶菌酶作用相比，分析其原因7，萝卜溶菌酶对金黄色葡萄球菌有抑制作用，推测其具有N,O-二乙酰胞壁质酶活性，能水解金黄色葡萄球菌细胞壁中的缩氨酸聚糖，因而能对金黄色葡萄球菌细胞壁有作用，此外，萝卜溶菌酶可能与革兰氏阴性菌外层成分的脂多糖无亲和性，因而能很好的水解革兰氏阴性菌细胞壁，抑制其生长。但是其具体的作用机理还有待进一步的研究与论证。3.3微生物源溶菌酶人们在20世纪60年代发现某些微生物也能产生溶菌酶。目前微生物产生

10、的溶菌酶大体上分以下5种8：（1）内N-乙酰己糖胺酶，类似于鸡蛋清溶菌酶，主要破坏细菌细胞壁肽聚糖中的-1，4糖甘键。（2）酰胺酶，主要作用于细菌细胞壁肽聚糖中N- 乙酰胞壁酸（NAM）与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键。（3）内肽酶，使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂。（4）-1，3、-1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶主要用于分解酵母细胞的细胞壁。（5）壳多糖酶，这是分解霉菌细胞壁的一种溶菌酶。 以采用微生物源溶菌酶- MML7为例，以多种常见标准菌株、临床致病菌和养殖常见致病菌作为检测指示菌 ,采用倍比稀释法测定 MML 对这些菌株的抑菌及杀菌作用。结果表明：MML 有较宽的抑菌谱 ,对

11、革兰阴性菌（大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门菌等） 、革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等）、真菌（白色念珠菌）都有不同程度的抑制作用，对临床分离的多种致病菌（肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等）和常见致病菌（鸡大肠埃希菌、鳗弧菌、副溶血弧菌等）都有较强的杀灭作用。 分析其作用机理主要有以下两种:一种是 MML 水解细胞壁中的糖苷键 ,破坏了细胞壁结构使细胞壁出现部分缺失 ,形成了L 型细菌 ,失去了对细胞的保护作用 ,细胞质解体出现空腔;另外一种作用是 MML 通过渗透进入细胞内吸附细胞内带有阴离子的细胞质 ,并发生絮凝作用 ,扰乱细胞正常的生理活动 ,从而杀灭细菌9。MML

12、对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌株的作用结果有所不同 ,主要是因为这两种细菌的细胞壁结构不同 ,MML 的两种作用对其影响程度也不同。对于大肠埃希菌 ,前面一种作用占主要地位 ,虽然细胞质出现凝集 ,但是由于细胞壁较薄 ,部分水解就使其失去了对细胞的保护作用,细胞质解体出现空腔造成细菌死亡;而对于金黄色葡萄球菌后者占主要地位 ,金黄色葡萄球菌细胞壁较厚 ,细胞壁的部分缺失并没有对其细胞壁的保护作用造成很大的影响 ,未出现空腔现象 , MML 对金黄色葡萄球菌的抑菌机理主要是通过渗透作用进入细胞内发生絮凝作用 ,吸附细胞质 , 导致出现了明显的深色成团物质，干扰细胞正常的生理活动造成细菌死亡10。

13、此外 ,MML对革兰阴性菌其作用，分析其原因，可能是外层成分的脂多糖无亲和性 ,因而能很好的水解革兰阴性菌细胞壁 ,抑制其生长。白色念珠菌属于真菌 ,其细胞壁主要成分为甲壳多糖 ,MML 之所以对其有明显的抑制作用 ,推测可能有两种原因:一是 MML 具有壳多糖酶或葡甘露糖酶活性 ,能够水解真菌细胞壁;二是与对金黄色葡萄球菌 MML 的作用机理类似 ,也是通过吸附细胞质成分干扰细胞代谢。和植物源酶作用机制一样，微生物源酶的具体作用机理也处于推测阶段，有待于进一步深入研究与论证。参考文献：1 林翠花,肖素荣,孟庆国.溶菌酶结构特点及其应用. 潍坊学院学报,2005(3):108-1102 赵眷海

14、 ，张法琴，唐旭日. 溶菌酶的研究. 酿酒科技,2007(5):55-563 白刃,杨百学,常洋,何剑斌. 溶菌酶及其应用.营养与日粮，2009（8）：46-484 Morrison ,D.C., and Ohno ,N.1989. Lipopolysaccharide interaction with lysozyme. Binding of lipopolysaccharide to lysozyme and inhibition of lsozyme enzymatic activity.J.Biological Chemistry, 2648:4434-44415 船津胜, 鹤大典.溶

15、菌酶.李兴福, 荆永志译校.济南: 山东科技出版社, 39-78; 257-2626 高向阳,袁四清,穆虹等. 萝卜溶菌酶抑菌效果的初步研究. 华南农业大学学报,18(2):72-747 卢亚萍,潘宏涛. Aegis溶菌酶的抑菌作用及抑菌机理初步研究. NEW FEED, 2007(12):15-188 杨向科,邹艳丽,孙谧,郑家声. 海洋微生物溶菌酶的抑菌作用及抑菌机理初步研究. 海洋水产研究,2005(10):62-659 Pelligrini ,A.,Thomas,U., Wild,P. et al. 1992. Bactericidal activities of lysozyme and aprotinin against gram2negative and gram2positive bacteria related to their basic character. J. Applied Bacteriology, 723:180-18710 任撑住. 红霉素及其衍生物的构效关系. 中国兽药杂志, 353:58-60