免疫学检验.ppt
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1、关于免疫学检验现在学习的是第1页,共92页第二节酶免疫检测技术第二节酶免疫检测技术1掌握酶免疫技术的基本原理掌握酶免疫技术的基本原理32熟悉均相酶免疫测定的类型及熟悉均相酶免疫测定的类型及 原理原理掌握掌握ELISA的原理及常用方法的类型的原理及常用方法的类型 与原理与原理熟悉酶免疫技术检测的判定熟悉酶免疫技术检测的判定4现在学习的是第2页,共92页第二节酶免疫检测技术第二节酶免疫检测技术5了解酶免疫技术常用酶及底物了解酶免疫技术常用酶及底物6了解酶免疫测定的应用了解酶免疫测定的应用现在学习的是第3页,共92页酶免疫检测技术酶免疫检测技术以以酶酶标记的标记的抗体(抗原)作为主抗体(抗原)作为主
2、要试剂,将抗原抗体反应的特异性和要试剂,将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催酶的高效催化化反应的专一性相结合的一种反应的专一性相结合的一种免疫检测技术免疫检测技术 一酶免疫检测技术(酶免疫检测技术(EIA)定义)定义现在学习的是第4页,共92页 酶标记抗体或抗原,和待检的抗原或抗体的免疫学进行特异性反应,形成酶标物的复合物,使底物基质水解而呈色,根据呈色反应对待检的抗原抗体作出定性定量。 很少量的酶即可导致大量的催化过程,所以极为敏感。二酶免疫技术的基本原理酶免疫技术的基本原理现在学习的是第5页,共92页Ag -Ab-E (Ag-E -Ab) S显色反应Ag (Ab)定性、定量 、定位分析酶免疫
3、基本原理酶免疫基本原理Ab-E(Ag-E ) + Ag (Ab)现在学习的是第6页,共92页灵敏度高、特异性强、准确性好灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。衍生出适用范围更广的新方法。三酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点现在学习的是第7页,共92页 (一)酶的要求(一)酶的要求 1 1、酶活性要非常高;、酶活性要非常高; 2 2、易标记具有抗原、抗体共价结合的基团;、易标记具有抗原、抗体共价结合的基团; 3 3、标记后不影响酶活性及抗
4、原抗体反应性;、标记后不影响酶活性及抗原抗体反应性; 4 4、酶活性不受样品中其他成分的影响(、酶活性不受样品中其他成分的影响(用于均用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活)或激活); 四常用的酶及其底物现在学习的是第8页,共92页5 5、产物易判定或测定、产物易判定或测定6 6、不能对环境和人污染、不能对环境和人污染7 7、稳定,价廉、易得、稳定,价廉、易得。现在学习的是第9页,共92页(二)常用的酶(二)常用的酶 1、辣根过氧化物酶(、辣根过氧化物酶(HRP) 活力高、稳定活力高、稳定 现在学习的是第10页,共92页 HRP在蔬菜作
5、物辣根中含量很高,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成。 HRP的纯度用RZ表示,是403nm的吸光度与280nm吸光度之比,高纯度的HRP的RZ3.0。 酶活力以单位表示:1min将1mol的底物转化为产物的酶量为1个单位。 现在学习的是第11页,共92页2、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶AP 敏感性强敏感性强 稳定性差稳定性差 价格高价格高现在学习的是第12页,共92页3、-Gal4、 脲酶 5、葡萄糖氧化酶现在学习的是第13页,共92页(三)常用的底物(三)常用的底物 1、HRP的底物的底物 : 四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMB 蓝色蓝色 邻苯二胺邻苯二胺OPD 黄色黄色 ABTS 蓝绿
6、色蓝绿色 现在学习的是第14页,共92页2、AP的底物的底物 对硝基苯磷酸盐对硝基苯磷酸盐 p-NPP 黄色黄色 现在学习的是第15页,共92页3 、-Gal底物 甲基伞酮基-D-半乳糖苷 (4-MUG) 均相酶免疫测定现在学习的是第16页,共92页定义定义 通过化学反应或免疫学反应,让酶与抗体或抗通过化学反应或免疫学反应,让酶与抗体或抗原形成的结合物原形成的结合物 作用:一是便于观察反应作用:一是便于观察反应 结果,二是提高测定结果,二是提高测定的敏感性。的敏感性。 五酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原1、酶标记物(酶结合物)、酶标记物(酶结合物)现在学习的是第17页,共92页酶标记物酶标记物
7、要求要求:既保有酶的催化活性;也保持了抗体(或抗原)的免疫活性;结合物尚要有良好的稳定性。现在学习的是第18页,共92页 抗原要求纯度高;抗原要求纯度高; 完全抗原完全抗原 抗体需要特异性好;抗体需要特异性好; 效价高;亲合力强以及比活性较高;效价高;亲合力强以及比活性较高; 能批量生产;能批量生产; 易纯化。易纯化。 2 2、抗原和抗体以及制备方法要求、抗原和抗体以及制备方法要求现在学习的是第19页,共92页单克隆抗体纯化的Ig抗体Fab现在学习的是第20页,共92页 技术方法简单;技术方法简单; 产率高;产率高; 重复性好;重复性好; 标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性;标记反应不影响酶和
8、抗原或抗体的活性; 酶标记物稳定酶标记物稳定 ; 不形成聚合物;不形成聚合物;现在学习的是第21页,共92页 过碘酸钠法过碘酸钠法-直接法直接法 常只用于常只用于HRP标记标记抗体或抗原抗体或抗原 原理:原理: 酶上的醛基和抗体上的氨基形酶上的醛基和抗体上的氨基形SCHIFF碱键。碱键。3 3、制备方法、制备方法现在学习的是第22页,共92页 戊二醛(戊二醛(GA)交联法)交联法 (间接法)(间接法)原理:原理:戊二醛交联法戊二醛是一种双功能戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂。团试剂。戊二醛的两个醛基分别和酶和抗戊二醛的两个醛基分别和酶和抗体分子中的游离的氨基和酚基以共价键形体分子中的游离的
9、氨基和酚基以共价键形式结合,形成式结合,形成SCHIFF键,将酶间接连在键,将酶间接连在抗体分子上进行标记。抗体分子上进行标记。 现在学习的是第23页,共92页优点:标记率高;优点:标记率高; 标记简单标记简单 酶利用率高;酶利用率高; 标记抗体分子质量小标记抗体分子质量小 染色效应好染色效应好 穿透能力强穿透能力强 产率高产率高 抗体活性丢失少抗体活性丢失少 酶活丢失少酶活丢失少 重复性好重复性好 缺点:标记方法复杂缺点:标记方法复杂 酶利用率低酶利用率低 穿透细胞能力一般穿透细胞能力一般 产率低产率低 抗体活性丢失较多抗体活性丢失较多 酶活力丢失较多酶活力丢失较多直接法直接法间接法间接法现
10、在学习的是第24页,共92页 原因:酶标记溶液中含有游离的酶和酶原因:酶标记溶液中含有游离的酶和酶- -酶酶 聚合物。聚合物。 方法:方法:50%50%饱和硫酸铵沉淀,再透析凝胶过滤。饱和硫酸铵沉淀,再透析凝胶过滤。4 4、酶标抗体结合物的纯化酶标抗体结合物的纯化现在学习的是第25页,共92页 酶标抗体的活性酶标抗体的活性 酶的活性酶的活性 酶标物中的酶量和抗体量酶标物中的酶量和抗体量 5 5、酶标抗体的鉴定酶标抗体的鉴定现在学习的是第26页,共92页 加甘油加甘油 低温保存低温保存5 5、酶标抗体结合物的保存酶标抗体结合物的保存现在学习的是第27页,共92页固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将
11、游离和固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面载体的表面 六固相载体固相载体现在学习的是第28页,共92页结合抗体或抗原的容量大结合抗体或抗原的容量大 结合物相当广泛(结合物相当广泛( 亲和素亲和素 生物素生物素 抗原抗原 抗体)抗体)抗体或抗原牢固地固定在其表面,相当稳定抗体或抗原牢固地固定在其表面,相当稳定不影响免疫反应性不影响免疫反应性 利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行,快速经济固相方法简便易行,快速经济1 1、
12、固相载体固相载体要求要求现在学习的是第29页,共92页2 2、固相载体固相载体种类种类塑料制品塑料制品 聚苯乙烯聚苯乙烯 微颗粒微颗粒 磁珠磁珠 膜载体膜载体 硝酸纤维膜硝酸纤维膜 NCNC现在学习的是第30页,共92页包被:包被:将抗原或抗体结合于固相载体将抗原或抗体结合于固相载体 条件条件 PH 9.6 t=37PH 9.6 t=37度度 T=4T=4小时;小时;t=4度度 过夜过夜 抗原和抗体的浓度抗原和抗体的浓度 3 3、包被与封闭包被与封闭现在学习的是第31页,共92页封闭:用封闭:用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血小牛血清将未被抗原抗体完全
13、覆盖的固相载体表面彻底包清将未被抗原抗体完全覆盖的固相载体表面彻底包被,避免载体表面对其后加入的酶标抗体或抗原产被,避免载体表面对其后加入的酶标抗体或抗原产生非特异性吸附,而产生假阳性显色。生非特异性吸附,而产生假阳性显色。原因:有些没有包被,露出的聚苯乙烯,非特异性原因:有些没有包被,露出的聚苯乙烯,非特异性反应,本底增高。反应,本底增高。现在学习的是第32页,共92页七酶免疫技术类别 (1)酶免疫组化(IEH) 定义:酶标记已知的抗体或者抗原,然后用酶标志的抗原或抗体与组织切片中的抗体或抗原发生反应,最后与酶底物作用发生显色反应,观察出标本中的抗原或者抗体的位置和性质,并可通过图像来分析进
14、行定量。1 1、根据应用目的 现在学习的是第33页,共92页优势:能克服荧光抗体染色标本不能长期保存,对组织细胞的细微结构分辨不清缺陷,且敏感性更高,对石蜡切片标本尤为适用,酶显色产物具有较高的电子密度,可用电镜观察。现在学习的是第34页,共92页步骤: (1) 标本的固定与保存: 固定使细胞内蛋白凝固,终止胞内酶活化,防止细胞自溶,保存抗原性。 固定剂:乙醇、丙酮、戊二醛等(2) 酶消化: 打开固定过程中由于醛键形成而被封闭的抗原决定簇(胃蛋白酶等)现在学习的是第35页,共92页3 免疫染色 标记抗体与标本中抗原反应形成复合物,洗去未结合成分,直接镜检。4、对照试验(control): Po
15、sitive: 已知抗原阳性的切片 Negative:不含已知抗原的切片 空白对照:排除组织自发荧光、内源性酶、生 物素等现在学习的是第36页,共92页 5 结果观察染色 特异性染色 非特异性染色显色部位 特定细胞或间质 细胞或间质均匀染 色或更强显色定位 特定,有结构性 无特定部位,无结 构性 显色程度 同一部位呈不同 无分布规律,某一 程度显色 片均匀着色现在学习的是第37页,共92页 (2)酶免疫测定)酶免疫测定(EIA) 用酶标记抗原或抗体做标记物,检测液体样液体样 品中品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。现在学习的是第38页,共92页(1 1)均相酶免疫测定)均相酶免疫测定(HE
16、I)(HEI) 定义:抗原和抗体反应后不分离游离的酶标物体和定义:抗原和抗体反应后不分离游离的酶标物体和酶标物的复合物,直接进行测定计算的方法。酶标物的复合物,直接进行测定计算的方法。 应用:测定小分子激素和半抗原(如药物)应用:测定小分子激素和半抗原(如药物)2 2、根据抗原抗体反应后是否需将酶标物的结合物和、根据抗原抗体反应后是否需将酶标物的结合物和游离的酶标记物分离游离的酶标记物分离现在学习的是第39页,共92页基本原理(竞争性)基本原理(竞争性) 酶标记物抗原(抗体)和待检的抗原酶标记物抗原(抗体)和待检的抗原(抗体)(抗体)与竞争性地相应的抗原(抗体)结合后,形成了抗与竞争性地相应的
17、抗原(抗体)结合后,形成了抗原抗体复合物、酶标物的结合物、游离的酶标物三原抗体复合物、酶标物的结合物、游离的酶标物三种物质。由于形成种物质。由于形成酶标物的结合物,酶的活性受到酶标物的结合物,酶的活性受到影响,影响,标记酶的活性会发生改变,不用分离结合标记酶的活性会发生改变,不用分离结合和游离酶标记物,通过测定标记酶的活性的改变,和游离酶标记物,通过测定标记酶的活性的改变,而确定抗原或抗体的含量。而确定抗原或抗体的含量。酶活性减弱或增强现在学习的是第40页,共92页+ Ag-E Ag-E -Ab+ Ag- AbAg-E + Ag + Ab(限量)竞争 酶活性酶活性或或,测定总酶活性,测定总酶活
18、性 换算可得换算可得 的含量的含量AgHEI基本原理:基本原理:现在学习的是第41页,共92页核心 竞争性结合 影响酶的活性现在学习的是第42页,共92页(A)酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术EMIT 定义:半抗原与酶结合成定义:半抗原与酶结合成酶标半抗元酶标半抗元,保留半,保留半抗原和酶的活力。当酶标抗原和抗体结合后,所抗原和酶的活力。当酶标抗原和抗体结合后,所标记的酶和抗体密切接触,由于空间阻止酶的活标记的酶和抗体密切接触,由于空间阻止酶的活力中心受到影响,而活性被抑制。力中心受到影响,而活性被抑制。现在学习的是第43页,共92页模式模式1EMIT1.AgEAb: 酶活性(Ab的空间位
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