细胞培养复习题(11页).doc

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1、-细胞培养复习题-第 11 页名称解释细胞培养（动物细胞培养）：动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。组织培养：从生物体内取出活的组织（多只组织块）在体外进行培养的方法。有时泛指所有的体外培养。器官培养：是将活体内的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的、配方恒定的培养基。无血清培养基：由基础培养基和替代血清的补充因子（生长因子和激素、结合蛋白等）组成。完全培养基：在合

2、成培养基里添加血清后的培养基。接触抑制：体外培养的细胞在贴附底物上连接成片、相互接触后失去运动的现象。无限细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。去分化（脱分化）：细胞在体外不可逆地失去原有特性。注意：去分化不意味分化能力完全丧失！在适当调节信号刺激下仍能表现出分化特性。但分化能力会随培养时间延长而逐渐丧失。不适应：各种分化细胞，在体外培养时逐渐失去各自的形态与功能特征，表现出某种趋同性。原因：培养条件变化使分化发生阻抑细胞分裂指数（MI）：是指细胞群中每1000个细胞中的分裂相数量细胞群体倍增时

3、间：是指培养物中细胞数量翻倍的时间。原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。1）体外培养细胞，其生长方式主要有贴壁生长和悬浮生长两种，分别称为贴壁细胞和悬浮细胞。2）一般可将贴壁细胞生长的体外培养细胞大体分为成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多行细胞型四种类型，最常见的为前两种。3）体外培养细胞的主要生长特点：贴附生长接触抑制密度依赖性 培养细胞分化状态的变化：去分化（脱分化）不适应1、细胞培养的基本要求有哪些和工作方法要

4、求：1）培养前准备2）操作间消毒3）洗手和着装4）火焰消毒培养前的准备的基本要求：培养基的选择和无菌配制动物细胞培养用液的类型、配制和无菌处理方法：1）操作程序规范2）试剂设备专人负责3）培养用品定点存放2、平衡盐溶液（BBS）：（1）成分：无机盐和葡萄糖，少量酚红。（2）作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度（3）常用：Hanks液、PBS等 消化液（1）作用：分散组织或细胞团。2）常用：胰蛋白酶消化液、胶原酶消化液、EDTA-2Na液、蜗牛酶等2、消化液中的胰蛋白酶消化液、胶原酶消化液、EDTA-2Na液作用的原理是什么？胰蛋白酶消化液主要作用是水解细胞之间的蛋白质，使细胞相互分离。EDTA-

5、2Na液：是一种化学螯合剂，其溶液又称Versen液，对细胞有一定的离解的作用。EDTA-2Na液的主要作用是通过结合（螯合）细胞间质中的二价阳离子从而破坏细胞之间的细胞连接。达到分散细胞的目的。胶原酶溶液：胶原酶是从细胞中提取的一种酶，对胶原组织和细胞间质有较强的消化作用，而对培养细胞一般不产生损伤，常在上皮类细胞原代培养时用来离散细胞与胶原组织。3、1）天然培养基：定义:主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。优点：含有丰富的营养物质，渗透压、pH等也与体内环境相似，培养效果好。缺点：成分复杂，批间差异大，易被支原体污染。2）合成培养基：根据细

6、胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成 的，配方恒定的培养基。 成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无 机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量固定。成本低。 缺点： 缺少某些成分，不能促进细胞增殖生长。3）完全培养基;定义：在合成培养基里添加血清后的培养基。细胞生长培养基:常用培养基，血清含量高, 10-20%。维持培养基:维持细胞不死或缓慢生长，血清含量低, 2-5%。4）无血清培养基：定义：由基础培养基和替代血清的补充因子（生长因子和激素、结合蛋白等）组成。用途：用于研究细胞生长因子、单克隆抗体制备、细胞分泌产物研究等。优点：保证实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少

7、细胞污染，简化提纯和鉴定等程序。 3、完全培养基中各成分的作用是什么？ 合成培养基（基础培养基）的成分只能维持细胞生存血清：常用牛血清，含有促进细胞增殖的各种生长因子和其他多种有利于细胞生存的物质。一定量的抗生素：防止污染 4、体外培养细胞与体内培养细胞的差异都有哪些？5、论述培养细胞的一代生存期可分为几个阶段及其特点？培养细胞的“一代生存期”，是指从细胞接种后到再次传代培养之前的这一段时间，它与细胞世代或倍增时间不同。可分为潜伏期、指数生长期、停滞期（平顶期）1.潜伏期特点：1）细胞适应新环境的恢复期（包括悬浮期、贴壁期、潜伏期三个时期）2）可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。2.指数生长

8、期特点：1）细胞增殖最旺盛的时期，细胞数量呈指数生长，是实验研究和生产的主要阶段。2）用细胞分裂指数和细胞群体倍增时间表示。3.停滞期特点：特点：细胞数量不再增加，仍有代谢活动6、动物细胞培养具有一系列优点：可简化细胞的生长环境。在细胞存活的基础上独立研究细胞生命活动、逐项研究细胞生存条件和细胞功能。能够方便地控制实验因素。 研究某种实验因素对细胞的生物学作用，只需在培养液中有针对性地加入或者删除这种成分。易于观测实验结果。利用细胞培养技术研究细胞的生命活动规律，可以很方便地采用各种实验技术和方法来观察、检测和记录。可供研究的细胞种类极其广泛。可同时提供大量均一性较好的细胞群，降低实验成本。能

9、够进行大规模生物制品的生产。包括酶、单克隆抗体以及多种疫苗等生物制品或者基因工程产品。2、动物细胞培养的缺点：体外培养的动物细胞对营养的要求较高。动物细胞生长缓慢，对环境条件要求严格。体外培养的细胞与体内生长的细胞存在或多或少的差异。（形态和功能的差异）7.动物细胞培养实验室有哪几个部分组成？理想的培养实验室可分为：准备室、缓冲室（与培养室相连的消毒房间，作为隔离培养室与外面非消毒房间的缓冲地带）、培养室（一间或几间），普通实验室、办公室。8.论述细胞培养的生长特点。培养细胞生命期：指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括三个阶段：原代培养期、传代培养期、衰退期。1.原代培养期 （也称初代培养

10、，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周） 特点：二倍体，细胞分裂次数少，异质性，独立生存性差。 用途：药物测试，疫苗制备等。2.传代培养期（定义：原代细胞接种到两个或以上的器皿继续进行培养标志进入传代培养期）特点：细胞分裂增殖旺盛，去分化，在全生命期中此期的持续时间最长，传代10-50次。3.衰退期（定义：传代培养一定代数后，细胞生命活动明显减弱，增殖很慢或不增殖，直至衰退死亡的时期。）细胞特点：细胞形态轮廓增强，色泽变暗，细胞质内出现暗的颗粒样结构及空泡状结构，胞质突起回缩，最后衰退凋亡。9.论述玻璃制品清洗步骤10、论述动物细胞培养技术的应用1.在生物学领域基础研究中

11、的应用（1）在细胞生物学上的应用 研究细胞的形态、结构、生长发育、细胞营养、代谢以及病变等微观过程。（2）在遗传学上的应用 染色体分析，杂交育种。（3）在胚胎学上的应用 通过体外培养卵母细胞，进行体外受精、胚胎分割和移植。（4）在病毒学上的应用 培养细胞为病毒的增殖提供场所。（5）在药理学领域的应用 药品、食品添加剂等对机体的毒性及其产生不良影响的安全性调查。（许多致畸、致癌物质加入动物细胞培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。）2.在临床医学上的应用（1）用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断 用羊膜穿刺技术获得胎儿细胞，培养后进行染色体分析，诊断胎儿是否患有遗传性疾病或先天畸型。（2）

12、用于癌症的早期诊断和预防 通过培养淋巴细胞，对其染色体进行对比分析检测出易患癌症的病人，进行及早的预防和治疗。（3）用于临床治疗 目前已有将正常骨髓细胞经大量培养后植入患造血障碍症患者体内进行治疗的报道。（4）用于药物效应的检测 检测的药物具有组织特异性时，可选用相应的细胞，如检测治疗肝病的药物可选用肝细胞、检测抗癌药物可选用癌细胞。3.在动物育种上的应用 新品种的培育可大大缩短育种进程，且更加经济有效。胚胎干细胞的研究成果和克隆羊多莉的问世为动物遗传育种开辟了一条新途径。4.在生物制品生产上的应用 用动物细胞可生产的生物制品有各类疫苗、干扰素、激素、酶、生长因子、病毒杀虫剂、单克隆抗体等。1

13、1、血清种类：人血清、牛血清、马血清等。成分：基本营养物、激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。标准: 透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌、支原体、病毒污染。 使用：逐步解冻，热灭活， 10%浓度，超低温保存。牛血清又分胎牛血清和小牛血清，它们的区别胎牛血清是从母牛剖腹取出的胎牛中分离出来的血清，对许多细胞系均有促进生长作用，主要用于细胞株的保藏及特殊娇贵细胞株的体外培养，但价格昂贵。小牛血清是从刚出生但尚未哺乳的小牛分离出来的血清。12、细胞传代方法贴壁细胞的消化法传代步骤（1）吸出或倒掉瓶内的旧培养液。（2）加入适量的消化液消化。（3）镜检，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化

14、。（4）吹打瓶壁细胞，制成细胞悬液。（5）计数，接种到新的培养瓶。悬浮细胞多采用离心法传代将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm离心5min,然后取出上清，加入新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液，然后传代接种。13、培养细胞的观察和检测技术1）培养液 观察培养液的颜色和透明度的变化。 正常培养液pH介于之间，呈桃红色、清亮透明。培养中细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。23天或34天换液一次。2）细胞生长状况 倒置显微镜观察。原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘“长出”细胞。成纤维细胞是最易生长的细胞。细胞长满瓶底80%应及时传代。3

15、、细胞形状变化 生长良好的细胞：透明度大，折光性强，轮廓不清。细胞生长状态不良的细胞：轮廓增强，细胞折光性变弱，边缘不齐，胞质中出现空泡、脂滴、颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞表面及周围出现丝絮状物。采取措施：换液、排污、废弃。4、微生物污染细菌污染：培养液浑浊、漂浮菌丝。支原体污染：生长减缓、胞质颗粒增多、培养液不变混。细胞交叉污染。化学物质污染。14、去分化和不适应的区别“去分化”不可逆（染色体变化）。“不适应”可重新诱导（培养条件变化）关于去分化需要注意： 去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态。如:高度分化的神经细胞和心肌细胞已经丧失的增生活性不可能恢复，但已经具备的生物电活

16、动特性不会完全失去 。可重新表现出分化特点。 如：把表皮细胞放在气液界面上培养，可分化成含大量角蛋白丝的角质细胞 、内皮细胞，但，这种能力会随着培养时间延长逐渐丧失。15、谷氨酰胺在培养基中的主要作用？配液时应该注意哪些问题？作用：在细胞代谢中有重要作用，是细胞合成核酸和蛋白质必需氨基酸，（在缺少时，细胞生长不良死亡）配液时：由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20度冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4度冰箱中储存2周以上时，还应重新加入原来的谷氨酰胺。第二章1、细胞冷冻的原理是什么细胞冻存的原则：慢冻快融 2）加冷冻保护剂（常用：甘油或二甲基亚砜（DMSO)）主要原因

17、：1）冷冻速度过快，细胞内水分结冰形成冰晶，造成细胞膜和细胞器的破坏引起细胞死亡。冷却速度越快，冰晶损伤越大。2）细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。冷冻保护剂作用机理：1）冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成 ；2）通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。2、复苏原理复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-50度，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，

18、避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害，以防止细胞内形成冰晶引起细胞死亡。3、细胞复苏的过程将恒温水浴箱的温度调至3740。从液氮中取出冻存小管，立即投入3740温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在12min内完成复温。将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻轻吹匀。 将细胞悬液经8001000 r/min离心5min。弃上清液。给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内，加培养液37、5%CO2培养。4、细胞活性检查1.染色法：使损伤或死亡细胞着色。结晶紫、台盼蓝、苯胺黑等。2.四唑盐（MTT）比色法：活细胞可沉淀四唑盐并形成蓝紫色结晶

19、，再用DMSO溶解结晶物，溶液颜色的深浅与所含的甲躜量成正比。用酶标仪在5 7 0nm波长处测定其吸光度OD值，可间接反映活细胞数。第三章1、原代细胞培养常用组织块培养法和消化培养法。2、组织块培养法 定义：组织块培养是即将组织剪切成小块后，接种于培养瓶培养的方法。基本方法：将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。特点：操作简便，组织块易损伤，细胞生长缓慢，适于组织量少的原代培养。基本过程：取材修剪冲洗；剪成1mm3左右的小块；移入培养瓶；间距5mm分布组织小块；翻转培养瓶37静止2-4h；翻正培养瓶培养；原代细胞培

20、养。3、消化培养法定义：利用组织消化分散法将细胞间质物质去除，使细胞分散，形成悬液培养的方法。特点：容易获得大量细胞，生长速度快，适于培养大量组织，但步骤繁琐，易污染，实验费用高。过程：消化分离法消化细胞、镜检；发现组织已分散成细胞团或单个细胞，终止消化，筛网过滤，大块继续消化；过滤的消化液，低速离心，加培养液，细胞计数后，接入培养瓶。4、原代取材的基本要求（1）无菌取材：严格无菌操作。（2）取材器械锋利：防止机械损伤。（3）及时培养：可培养液4暂存。（4）去除无用组织，避免干燥。（5）营养丰富：添加10%血清。（6）采用易培养组织：组织类型、分化程度、年龄等。（7）作好记录：来源等信息及标本

21、要保留。5、组织材料的分离1) 细胞悬液的分离方法 来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，可采用离心法分离。一般采用50001000r/min的低速离心510分钟。2)组织材料的分离方法 可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。1.机械分散法 方法:注射针芯挤压法。 特点:简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。2.剪切分散法 利用剪切法将组织剪切成1平方毫米的小块。3.消化分离法 定义：消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分散的方法。 种类：胰蛋白酶法、胶原酶法、EDTA法。6、应用体外培养技术进行中瘤研究具有的优点1，可以免受

22、机体内部因素的影响，从而便于研究理化和生物等因素对肿瘤细胞生命的影响2、便与研究肿瘤细胞的结构和功能3、肿瘤细胞可长期保存以便观察其遗传行为的变化4、可用抗癌药物的快速筛选7、肿瘤细胞培养生物学特性：永生性、侵袭性，不受控增殖性，遗传性质改变，异质性、成瘤性。第四章动物细胞大规模培养技术：指在人工条件下，在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术微载体：微载体指直径在60250微米，能适用于细胞贴壁培养的微珠，一般由葡聚糖或各种合成聚合物组成。中空纤维培养技术：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用中空纤维给培养细胞提供物质代谢条件而建立的一种大规模培养方法微囊化培养是指在无菌

23、条件下将拟培养的细胞、生物活性物质以及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再将微囊放入培养系统内进行培养的方法。1、动物细胞大规模培养的方法 1.贴壁培养2.固定化培养3.悬浮培养（一）贴壁培养定义：指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养方式。优点：适用细胞种类多；容易采用灌流培养；容易更换培养液。缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差，投资大。培养方式：旋转瓶培养、中空纤维培养、细胞工厂培养、微载体培养。（二）固定化培养定义：将动物细胞与水不溶性载体结合起来进行培养的方式。优点：既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养，细胞密

24、度高，抗剪切力和抗污染力强，易于分离纯化。方法：吸附法、包埋法、微囊法（三）悬浮培养定义：指细胞在生物反应器中自由悬浮生长的培养方法。优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。缺点：体积小，较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌式和气升式。2、微载体的选择有何要求微载体表面性质与细胞有良好的相容性，适用细胞附着、伸展和增殖；微载体无毒、惰性，不与培养基成分发生化学变化，也不会吸收培养基中的营养成分；微载体的比重在，使载体在低速搅拌下就可悬浮，而在静止时又可很快沉降，便于换液和收获；粒径在60250m（溶胀后）之间，均一，差异不大于20 m 。有利于细胞

25、均匀分布在各微载体表面；具有良好的光学透明性，利于观察细胞在载体上的生长情况；可耐120高温，便于采用高压蒸汽灭菌； 原料充足，价廉，制备简便，经简单的适当处理后，可反复多次地使用。3、微载体培养的操作包括哪些步骤培养初期阶段；粘附贴壁阶段；维持培养阶段；细胞收获阶段；微载体培养放大阶段4、大规模培养技术的应用5、微囊化培养中微囊的制备应注意哪些问题1）温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作2）所用试剂和膜材料对细胞无毒害3）膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过4）膜应有足够机械强度抵抗培养中的搅拌。6、理想的动物细胞生物反应器应满足哪些基本要求？使比较教材所介绍的几种生物

26、反应器各自优缺点能提供充足氧气；良好的传质传热及密闭性能；制备材料对细胞无毒；有自动检测调控系统；便于操作维护。1、搅拌式细胞生物反应器 优点：避免向培养基直接通气时气泡损伤细胞，没有移动部件，密封好，氧转换率较高，便于放大。 缺点：氧传递系数小，气路系统不能就地灭菌。2、气升式动物细胞培养反应器 优点:器内气流温和均匀剪切力小，完全密封，便于无菌操作，氧的转换率高，便于放大生产 缺点：1）这种生物反应器只能用于需要气体的反应，或者是需要有气体的场合2）在培养细胞的过程中会产生大量的气泡，从而会对正在培养的细胞的生长产生影响3）这种生物反应器，如果没有其他装置的帮助就只能培养悬浮生长的细胞。3

27、、中空纤维细胞培养反应器 优点1）培养器体积小，细胞高细胞损害小；2）浓缩产品；3）易于分离产物，产物纯度高，不易污染；4）自动化程度高，细胞生长周期长。 缺点:细胞生长速度慢，代谢物容易堵塞孔径，不易清洗维护，价格高第五章抗原上可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。抗体：是指机体受抗原刺激后产生的能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。单克隆抗体：即单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。多克隆抗体：一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，进入机体后会刺激好几中B细胞

28、增殖，因而使机体产生几种不同的抗体，成为多克隆抗体基因转染技术：将外源性基因采用化学或物理的方法人工导入细胞的技术。主要用于癌基因研究。1、 什么是单克隆抗体？其特性和局限性如何？与多克隆抗体有何异同？单克隆抗体是由一种B细胞克隆所产生的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子。局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围；反应强度不如多克隆抗体；制备技术复杂，费时费工，价格较高。特性：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制不同：单克隆抗体的特异性强，只针对单一的抗原表位；而多克隆抗体则可以与多个抗原表位结合，当抗原的某个抗原表位改变时，单抗不能发挥其

29、作用2、简述单克隆抗体的制备流程和应用。应用：1）用于疾病的诊断和治疗：2）作为载体制备导向药物。3、骨髓瘤细胞和脾细胞融合过程中应特别注意的几个问题是什么1)细胞比例2）反应时间3）反应温度4）PEG的选择4、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理1）要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但B淋巴细胞不能在体外生长。2）而骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞融合，得到杂种骨髓瘤细胞。3）杂种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特

30、异单克隆抗体。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。5、HAT筛选杂交瘤细胞原理细胞融合时加入HAT（H为次黄嘌呤、A为氨基喋呤、T为胸腺嘧啶）选择系统，目的是保证只有杂交瘤细胞的生长。HAT培养基是含有由次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶(T)、的一种选择性培养基，这三种成分与细胞DNA合成有关。A可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨基碟呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。这时正常细胞可以通过“补救合成途径”,由胸腺嘧啶激酶（HK）和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用T和H合成核酸而繁殖。骨髓瘤细胞都是HGPRT缺乏株，不能利用H和T合成

31、DNA，而B细胞中有这种酶，但在体外培养只存活57天，所以只有脾-瘤才能在HAT选择培养基上生长。6、酶联免疫吸附法（ELISA）原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 第六章外植体：用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段）。愈伤组织：在人工培养基上，由外植体的表面形成的一团不定形的排列疏松的薄壁细胞。细胞全能性：植物的每个细胞都携带一整套遗传信息，具有发育成完整植株的潜力。 脱分化：已经分化的细胞、组织、器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞和组织的过程。

32、 再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化为胚状体或直接分化出器官。植物细胞培养：在离体条件下将易分散的植物组织或植物的愈伤组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞（单个细胞），通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。1、植物组织与细胞培养的区别与联系培养对象不同植物组织培养包括植物器官和组织如根、茎、叶、花、果实、种子等。动物细胞培养包括各种单细胞、单倍体细胞、原生质体、小细胞团、固定化细胞等。愈伤组织培养既属于组织培养又属于细胞培养。培养目的不同 组织培养：获得植物组织和再生成植株，或利用发状根培养生产某些次级代谢物。主要用于植株的产业化生产和繁育

33、。 细胞培养：获得细胞和产物，进行生物转化，进行种质保存、人工种子的制备和植株的大规模快速繁殖。2、外植体的选择和预处理1、外植体的选择：适当生长期的健康植株、细胞之间粘连程度小，如 叶片组织。2、外植体的预处理：（1）冲刷材料： 流水 ，几分钟-数小时，加洗衣粉、 吐温等表面清洗剂。 (2) 表面浸润灭菌：超净台，70%酒精，10-30S。（3）深层灭菌：氯化汞、次氯酸钠等。 （4）无菌水冲洗。 3min/次，3-10次。3、愈伤组织培养的一般程序1.培养基配制2.愈伤组织诱导3.继代培养4.从愈伤组织分离得到细胞4、一个好的悬浮细胞系有哪些特征？用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何要求？特性：

34、松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。要求：选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶是最常用的外植体，特别是幼胚。选择适宜的培养基：生长素浓度很重要配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。愈伤组织要进行继代选择：选择疏松好、细胞状态好的细胞不断继代培养。5、为什么要进行植物组织固定化培养虽然细胞悬浮培养能够产生大量次生代谢物，但是人们所期待的次生代谢物往往产量不高，细胞固定后的密集而缓慢的生长有利于细胞的分化和组织化，从而有利于次生代谢物质的合成。此外，细胞固定化后不仅便于对环境因子的参数进行调控，而且有利于在细胞团间形成各种化学物质和物理因素的梯度，这可

35、能是调控高产次生物质的关键。与植物悬浮培养比较，固定化植物细胞具有稳定性好，产物容易分离、利于连续花生产等特点。但是只适用可以分泌到细胞外的次级代谢物的生产。6、常见的植物细胞生物反应器有有哪些？各有和优缺点？1）搅拌式生物反应器 优点：混合性好，传氧效率高，操作弹性大，可用于细胞高密度培养等。缺点：由于植物细胞对搅拌是所产生的剪切力的忍耐力较差，传统的搅拌式生物反应器通常易对细胞产生伤害。2）气升式生物反应器 优点：剪切力小，结构简单，好的无菌状态。氧的传递速率较高。缺点：操作弹性小，低气速在高密度培养时，其混合效果较差，植物细胞生长较慢。3）鼓泡式生物反应器 优点：容易长期保持无菌操作 缺点：混合性能差，对养的利用绿较低，对于高密度及黏度较大的培养体系，反应器培养效率会降低。4）填充床式生物反应器 优点：单位体积固定细胞量大，反应速率较大， 缺点：混合不均匀、床内氧传递速率等5）流化床式生物反应器 优点：混合效果好， 缺点：流体的切变力和颗粒的碰撞常造成颗粒破损而使细胞外流，同时流体学的复杂性也使其放大困难，6）膜反应器 优点：容易控制，易于放大、产物一分离。简化了下游工艺等 缺点：膜材料的限制，构建莫反应器的成本较高。