脂肽抗生素的研究概况(10页).doc

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1、-脂肽抗生素的研究概况-第 10 页6 脂肽抗生素的研究概况脂肽（Lipopeptide）又名脂酰肽（Acylpeptide），是一类重要的抗菌肽，主要来源于一些由细菌、酵母菌、真菌分泌的代谢产物，其种类繁多、结构复杂，是一类由脂肪链和肽链组成的具有两亲结构的微生物次级代谢产物（Kosaric，1987）。脂肽一般来源于植物、动物和微生物，但大多数脂肽来源于微生物，而其中又以来源于细菌的脂肽居多。在细菌中，脂肽一般是革兰氏阳性芽孢杆菌产生的代谢产物。1968年，Arima等首次从枯草芽孢杆菌株发现脂肽类表面活性剂，呈晶状，商品名为表面活性素（surfactin）（Arima，1968）。目前发

2、现的抗菌脂肽主要有表面活性素（surfactin）、芬荠素（Fengycin）、伊枯草菌素（iturin）、和杆菌霉素（Bacillomycin），抗霉枯草菌素（mycosubtilin）、制磷脂菌素（plipstatin）等。脂肽分子由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，脂肽分子中多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，脂肪烃链形成亲油基。由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽除了具有抗菌活性之外还具有生物表面活性剂的特性（Stein，2005）。脂肽在环境治理，医药、微生物采油等领域有重要的应用前景（Jitemdra，1997；Banat，2003）。6.1 脂肽抗生素的种类及结构特性芽孢杆

3、菌产生的抗菌脂脂肽的分子结构由脂肪酸链和肽链两部分组成，分子中的多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，-羟基或者氨基脂肪酸的烃链形成亲油基，即是具两亲性的生物表面活性剂。其中亲水的氨基酸通过肽键相互连接，再与脂肪烃链上的羧基和-羟基或者氨基结合形成环状，因此，抗菌脂肽一般是以内脂或者酰胺键结合而成的环脂肽（刘向阳，2005；吕应年，2005；Wang，2004）。芽孢杆菌脂肽抗生素主要包括表面活性素（Surfactin），伊枯草菌素（Iturin），芬荠素（Fengycin）三大类。6 表面活性素（Surfactin）Surfactin类群的脂肪酸的碳链长度在1316个，具有LLDLLDL的手性七肽

4、通过一内酯键与脂肪酸链碳原子的-羟基基相连，其在水溶液中分子成“马鞍状”构像，该家族成员包括枯草芽孢杆菌产生的表面活性素（Surfactin），地衣芽孢杆菌产生的地衣芽孢杆菌素（Llichenyishin），短小芽孢杆菌的表面活性剂（Pumilacidin）、埃斯波素（Esperin），其中Liehenyishin、Pumilacidin、Esperin主要应用于工业和环境治理（Meiji et al.，1969.；Yakimo et al.，1995；Naruse et al.，1990）。而Surfactin是一种脂肽类抗菌物质，它是由-羟基脂肪酸和7个氨基酸残基的小肽组成，肽链的第7位氨

5、基酸上的羧基和脂肪酸的-羟基缩合形成环状结构（如图1-1）。Surfactin主要存在两种类型，即7位上的氨基酸是Leu和Val。肽链中典型的氨基酸组成顺序为(L-)Glu-(L-)Leu-(D-)Leu-(L-)Val-(L-)Asp-(D-)Leu-(L-)Leu（Kowall et al.，1998；杨世忠等，2004）。但是由于其2位（Leu/Ile/Val）、4位（Val/Leu/Ile/Ala）、7位（Leu/Val/Ile）氨基酸的不同及脂肪酸链长短（C13C15）的不同其类似物也较多（刘向阳等，2005）。1991年Baumgart用二维H-NMR证明Bacillus subt

6、ilis ATCC21332和Bacillus subtilis OKB105培养液中提取的Surfactin具有三种结构类似物（Baumgart et al.，1991），分别命名为Surfactin A、Surfactin B、Surfactin C、其中surfaetin A是主要成分，它的环状肽链上第七个氨基酸为Leu，Surfactin B的七位氨基酸为Val，Surfactin C的七位氨基酸为Ile。1992年Oka等采用优化后的高效液相色谱（HPLC），首次对枯草芽孢杆菌产生的六种表面活性素分离成功，并发现了两种具有不同脂肪酸取代物的新表面活性素。1995年俄罗斯科学家研究从发

7、酵液中得到5个Surfactin的结构类似物，通过质谱技术、化学修饰和二维核磁共振技术确定了它们的结构。随后的研究更精确地测定了十余种Surfactin的同系物（Kowall et al.，1998），如表1-1 （Vater et al.，2002）。Surfactin表现出抗病毒、抗肿瘤和支原体以及一定程度的抗细菌活性，它本身并不具备抗真菌活性，但可增强其它脂肽特别是伊枯草菌素的抗真菌活性（Kim et al.，2004）。图1-1 Surfactin的结构示意图 Structure of surfactin表l-1 surfactin同系物的种类Table1-1 Sorts of sur

8、factin isoforms6 芬荠素（Fengycin）Fengycins类群包括芬荠素（Fengycin）和制磷脂素（plipastatinAl、A2、B1、B2）脂肪酸链碳链长度一般在1418个，8个氨基酸成环，线状部分包括2个氨基酸和脂肪酸链（Nongnuch et al.，1986）。肽链中氨基酸组成顺序为(L-) Glu- (D-) Orn- (L-) Tyr- (D-)Thr-(L-)Glu-(D-)Ala（Val)-(L-)pro-(L-)Gln-(D-)Tyr-(L-)Ile，肽链的第10位Ile上的羧基和第3位的Tyr上羟基缩合形成环状结构（Vanittanakom et

9、 al.，1986；Ongena，2005；Sehneider，1999），如图1-2。Fengycin能够抑制丝状真菌生长，对酵母和细菌无作用（Vanittanakom et al.，1986）。它和Surfactin一样有许多同系物，往往同时共存于发酵液中。它们被分成Fengycin A和Fengycin B两种类型，当肽链的6位上是Ala时，属于fengyein A；而当肽链的6位上是Val时，属于FengyeinB（Wang J，2004；Steller S，1999；Deleu，2005）。2008年Das还发现了苏云金芽孢杆菌cMB26（ CMB26）产生的结构类似于Fengyci

10、n的脂肽抗生素（Kim et al.，2004）。常见的fengycin同系物如表1-2（Stinson，2003；高学文，2003）。图1-2 Fengycin A的结构示意图Fig.1-2 Structure of Fengycin A表l-2 Fengycin同系物的种类Table1-2 Sorts of fengycin isoforms6 伊枯草菌素（Iturin）Iturin家族包括伊枯草菌素（Iturin）A、B，杆菌抗霉素（Bacillomycin）D、F、L，抗霉枯草菌素（Mycosubtilin）以及杆菌肽素（Bacillopeptin）A、B、C（陈华等，2008；Fra

11、neoise et al.，1984；Aicha et al.，1982；Yoshio et al.，1995），其脂肪酸链碳链长度一般在1417个，具有LDDLLDL手性7个强极性氨基酸短肽的N端氨基通过形成肽键脂肪酸链羧基相连（图1-3）。其中最有代表性的Iturin A是由一个含有C14C17的-氨基脂肪酸和7个氨基酸残基的环状结构组成，7位上的Ser的羧基基和-氨基脂肪酸的氨基缩合形成环状结构（Hiradate et al.，2002；Besson et al.，1978）。伊枯草菌素具有较强的抗真菌活性（Besson et al.，1978），也有部分抑制细菌的作用。Iturin的种

12、类及其分子量见表l-3。Iturin能强烈抑制植物病原真菌还有部分细菌甚至还有杀虫作用。图1-3 Iturin的结构示意图 Structure of Iturin表l-3 Iturin同系物的种类Table1-3 Sorts of Iturin isoforms6.2 脂肽抗生素的合成机理Lipmann在20世纪70年代首次开展了对肽生物合成的非核糖体机制分析，随后越来越多抗菌脂肽合成的相关基因被克隆、分析，结合全基因组测序的开展，获得了大量脂肽抗生素合成和调控的遗传信息（chen et al.，2009）。总之，芽孢杆菌的脂肽类抗生素的合成受一个由合成基因、调控基因共同组成大的基因簇控制，这

13、些基因簇含有一个或多个转录单元，并且他们的表达是协同调控的，相似主链结构的脂肽抗生素产物是由相似的合成基因合成的。酶的活性或者存在于一个大的功能蛋白的不同结构域中，或者组织于一个多酶复合体中，脂肽抗生素的合成相关基因见表1-4。与核糖体合成的蛋白不同，非核糖体合成的脂肽抗生素的生物合成不以mRNA作为模板，也不需要携带工具tRNA，而是由多个肽合成酶组成的巨大复合物NRPS（non-ribosomal peptide synthetases），通过一种称为“多载体硫模板机制（Multiple Carrier Thiotemplate Mechani-sm）”的方式来合成的（Mohamed，19

14、97；Saseha et al.，2001）。NRPS是目前已知分子量最大的酶，它的运作是不依赖于核酸模板的非核糖体机制，它们在一种模板的指导下，能够识别特定的氨基酸并将其直接连接形成多肽链。每个肽合成酶都有一个或几个模块（module），每个模块都是一个独立的功能单元，大约由1000个氨基酸残基组成，负责将特定的氨基酸掺入肽链中。肽合成酶的模块排列顺序决定了产物中氨基酸的排列顺序，因此肽合成酶既是肽链合成的催化剂，也是肽链合成的模板。每一块模板负责一个反应循环，主要包括识别选择性底物并将其活化为相应的腺苷酸化合物，固定共价中间物和形成肽键。每一块模板在结构上又可以分为3个结构域：腺苷酸化结构

15、域A、疏基化结构域T和缩合结构域C。腺苷酸化结构A域负责识别特定底物并通过ATP对底物进行活化；疏基化结构域T也被称为肽酰基载体蛋白（PCP），它负责固定反应中间物硫酯；缩合结构域C可以催化第一个模块的氨基酸脱离其载体，进而与第二个模块上的氨基酸形成肽键，如此新合成的肽链便向前移动了一个模块，不断延伸直到形成脂肽化合物。芽孢杆菌以不同的模块为模板，结构域有机结合发挥作用，形成多种多样的非核糖体肽。表1-4 脂肽抗生素合成相关基因Table l-5 Lipopeptides synthesase-related genes6.3 脂肽抗生素的应用抗菌肽的应用研究主要集中在农业生物防治、食品工业、

16、畜牧生产业、医药行业、环境保护等领域。农业生物防治主要是是指脂肽应用于植物病原菌的生物防治（高芬等，2003；Vollenbroich，1997）。这是由于脂肽抗生素具有广谱的抗霉菌作用和一定的抗细菌作用，而其抗菌机理又不同于一般的抗生素，它可以使微生物的细胞膜上形成孔洞而使细胞内容物流出而死亡或鳌合一、二价阳离子从而抑制了多种酶类活性，不易产生耐药性（Steller，1999；Deleu，2005）。此外，肽类物质在自然界中易分解，属于环境友好类制剂，所以，在医药、植物病原菌的控制等方面具有广阔的应用前景。一些学者已经将抗菌脂肽的研究应用于植物病原真菌的抑制。黄现青研究了枯草芽孢杆菌fmbJ

17、产生的脂肽对点青霉的抑制活性，测定了其抗菌谱，并进行了桃防腐试验。桃防腐试验表明其防腐效率可以达到76.5%，具有良好的桃防腐应用前景。Yu等将Bacillus amyloliquefaciens产生的iturinA用来防治西红柿的丝核病菌（Yu et al.，2002）。在食品行业中的应用主要是把脂肽作为食品防腐剂，并对此进行了大量的应用研究。食品安全和动物食品安全有赖于生产过程的各个环节，解决问题的一个关键就是使用无污染、无残留、无毒副作用的食品添加剂。抗菌脂肽是小分子短肽，参与生命过程，具有安全无毒副作用的生物学特性（Zasloff，2002）。脂肽还可以用于环境保护方面。脂肽作为表面活

18、性剂，由于他们带有负电荷，可以结合带正电荷的金属阳离子，所以可以选择性去除土壤中的Pb、Zn、Cu等金属离子，其中Cu是最易去除的。有文献报道地衣芽孢杆菌产生的脂肽地衣素是比表面活性素更稳定的阳离子鳌合剂（Catherine et al.，2001）。脂肽抗生素也可以用于医药行业。医药行业上脂肽的研究主要集中在动物疾病防治及人类抗真菌药物、抗病毒药物、抗肿瘤药物、抗原虫药物的研制上（Hino et al.，2001.；Rowley et al.，2004；Boulanger et al.，2004；汪以真等，2004）。脂肽类表面活性剂也可用于微生物采油方向。由地衣芽孢杆菌NK-X3产生一种脂

19、肽类生物表面活性剂，在pH为412和钙离子质量浓度为4000 mg/L的条件下，于120 高温下不失活，这些特点有利于该产品在原油的增采和输送中使用（范立梅，2000；梅建凤，2001）。Bacillus subtilis ZW-3是王大威等人从大庆油田分离到一株枯草芽孢杆菌，其代谢产生的脂肽表面活性剂具有优良的乳化和降低油水界面张力的能力，可以提高采油率9.2%，在微生物采油中具有良好的应用前景（王大威等，2008）。6.4 脂肽抗生素的分离和鉴定6 脂肽抗生素的分离纯化脂肽抗生素的分离纯化方法主要有沉淀法、萃取法、色谱法、超滤法、吸附法、泡沫分离法、液膜分离法（黄翔峰等，2009）。沉淀方

20、法有多种，如硫酸盐（80%）沉淀、MnCl2（10 mM）沉淀、浓盐酸（6 N）沉淀等。酸沉淀是调节样品溶液的pH值，使其达到酸性条件（一般pH=2），4 静置过夜使溶液中的物质完全沉淀或经轻微搅动加速其沉降，最后离心得到粗产物。酸沉淀是使用最普遍的，原因是脂肽抗生素绝大多数都具有耐强酸的性质，且操作简单，效果显著。但酸沉淀法得到的产物往往纯度不是很高。有文献报道，酸沉淀得到Surfactin产物的回收率可达97%，但纯度只有55%（Chen，2008）。萃取法主要是去除脂肽抗生素粗产物中的亲水性杂质。常用的萃取剂有甲醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、己烷等，这些溶剂既可以单独使用，也可以混合使用

21、。使用最普遍的是甲醇，能够溶解绝大多数脂肽抗生素。色谱法可以提高样品的纯度，这是沉淀法和萃取法很难做到的。色谱法主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）、吸附色谱（adsorption chromatography，AC）、硅胶柱层析（silica gel column chromatography）以及薄层层析（thin layer chromatography，TLC）等。高效液相色谱分离得到的产物纯度高，是分离纯化脂肽抗生素应用较多的一种

22、色谱技术。别小妹用高效液相法表明了Bacillus subtilis fmbR抗菌物质含有保留时间与Surfactin相似的成分（别小妹等，2006）。Kowall等以100RP 18-TS为色谱柱分离出Surfactin的13种不同结构体（Kowall et al.，1998）。6 质谱在物质鉴定中的应用1918年，丹姆斯德（A. J. Dempster）制成了半圆形磁场的第一台单聚焦质谱仪，1958年克劳斯比曼（Klaus Biemann）教授首先用质谱仪分析氨基酸。质谱有多种电离方法，包括场解吸、等离子体解吸、激光解吸、快速粒子轰击、电喷雾电离和大气压电离等（李承雷，2007）。1987

23、年由于在生物分子中引入了基质辅助激光解吸电离（Matrix-Asisted Laser Desorption Ionization，MALDI）以及电喷雾电离（Electrospray Ionization，ESI），质谱技术有了跃进。这两种电离技术也给肽和蛋白质分析带来了极大飞跃。目前生物质谱的质量分析器主要有四类：离子阱（ion trap，IT）、飞行时间（TOF）、四极杆（Q）、和付立叶变换离子回旋共振（Fourier transform ion cyclotroresonance，FTICR）。他们在设计和构造上各有不同，因而各有优缺点，既可以单独使用，也可以互相组合形成功能更强大的仪

24、器。ESI-MS是美国耶路大学Fenn教授和他的同事在80年代后期提出的。ESI是当今有机质谱中最软的电离技术，它是将蛋白质的弱酸性水或水溶剂溶液通过毛细管导入大气压电离源内（Atmosphere Pressure Ionization，API），在气化气的帮助下和源内毛细管终端和反电极之间的强电场作用下，样品溶液形成带电荷的雾，即电喷雾。这些雾滴在热氮气流下蒸发，半径逐渐缩小，雾滴表面的电场不断增强到某一临界点时发生离子的场发射，或溶剂完全蒸发。生成的样品气相离子经质量分析器分析，测出它们的质/荷比。ESI-MS既可分析大分子也可分析小分子。对于分子量在1000Da以下的小分子，会产生M+H

25、+ 或M-H离子，选择相应的正离子或负离子形式进行检测，就可得到分子量（杨松成，2000）。而高达20000Da大分子在ESI-MS中生成一系列多电荷离子，通过数据处理系统能够得到样品的分子量，准确度高于0.01%。ESI-MS不仅可与四级质谱相连，它还能与离子阱、飞行时间质谱及付立叶变换离子回旋共振。研究表明，ESI-MS技术是分析脂肽化合物复合体中各组分的相对分子质量及分子结构的有效工具（陈华等，2008）。基体辅助激光解析电离（MALDI）是由德国科学家Karas和Hillenkamp所发现的。MALDI通常与无质量检测上限飞行时间质谱（TOF-MS）联用，称MALDI-TOF-MS，广

26、泛用于对蛋白质的分析、鉴定（Muller et al.，2006；Howard et al.，2007）。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学领域的研究提供了一种强有力的分析手段（王晔茹，2007）。它的工作原理是：将微量样品与过量小分子基体的混合溶液点加在样品的靶盘上，溶剂挥发后样品与基体在靶上形成共结晶。将靶盘装入质谱仪的离子源内，当脉冲激光照射到靶点上时，基体吸收了激光的能量跃迁到激发态，导致了样品分子的电离和气化。电离通常是基体上的质子转移到样品分子上或者从样品分子上得到质子。然后由高电压将电离的样品分子从离子源转送到质量分析器内，将检测到的离子峰

27、为纵坐标，离子质荷比（m/z）为横坐标，形成质量图谱（杨松成，2000）。MALDI-TOF-MS分析时样品制备是分析成败的关键。MALDI-TOF-MS分析时能耐受一定量的小分子像盐、去污剂等，且信息直观、操作简单、快速准确（吴多加，2005），是在微生物检测和鉴定中应用的一种质谱新技术。表1-5是部分脂肽抗生素物质分子单同位素理论分子量及相应离子质荷比值。表1-5 脂肽抗生素理论分子量及相应离子质荷比值Table l-5 The oretical molecular mass of lipopeptides and corresponding m/z value脂肽MM+H+M+Na +M

28、+K +C13Iturin AC14Iturin AC15Iturin AC16Iturin AC17Iturin AC18Iturin AC13Iturin BC14Iturin BC15Iturin BC16Iturin BC17Iturin BC18Iturin BC14MycosubtilinC15MycosubtilinC16MycosubtilinC17MycosubtilinC14Bacillomycin DC15Bacillomycin DC16Bacillomycin DC17Bacillomycin D C14Bacillomycin FC15Bacillomycin FC

29、16Bacillomycin FC17Bacillomycin FC14Bacillomycin LC15Bacillomycin LC16Bacillomycin LC17Bacillomycin LC13Surfactin AC14Surfactin AC15Surfactin AC16Surfactin AC13Surfactin BC14Surfactin BC15Surfactin BC16Surfactin BC13Surfactin CC14Surfactin CC15Surfactin CC16Surfactin CC14Fengycin AC15Fengycin AC16Fengycin AC17Fengycin AC18Fengycin AC14Fengycin BC15Fengycin BC16Fengycin BC17Fengycin BC18Fengycin B