补体检测及应用(5页).doc

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1、-补体检测及应用-第 5 页第十九章补体检测及应用补体是一组存在于人和脊椎动物血清、组织液或某些细胞膜上的具有酶样活性、不耐热的糖蛋白。补体不是单一成分，其在功能效应上是以连续反应的程序进行的，故又称补体系统。补体系统广泛参与机体的抗感染防御反应及免疫调节，也可介导免疫病理的损伤性反应，是体内具有重要生物学作用的效应放大系统。补体的存在与抗原性异物的刺激无关，在正常人血清中，其含量相对稳定，但在某些疾病发生时，补体的含量及其活性可发生改变。因此，补体含量与活性的检测，对机体免疫状态的评价和疾病的诊断具有重要意义。 第一节概述一、补体成分的含量与理化特性（一）补体成分的含量：补体大多为糖蛋白，属

2、于球蛋白，C1q、C8等为球蛋白，C1s、C9为球蛋白。C3含量最高。补体活化后的裂解片段以该成分的符号后加小写英文字母表示，通常a为小片段，b为大片段，但C2a为大片段，C2b为小片段。补体各成分活化后不参与溶细胞过程的裂解片段，同样具有其他对机体利弊兼有的生物学活性，故裂解片段的测定，一方面可反映机体补体的活性状态，另一方面也是某些疾病诊断不可或缺的指标。补体系由非均一的细胞群体产生，在排除补体消耗太多的前提下，补体缺陷也可反映这些细胞的状态。体内合成补体成分的部位和细胞有多种，以肝脏、脾脏、小肠等组织和巨噬细胞、上皮细胞、血小板等细胞为主。（二）补体的理化特性：补体的性质不稳定，易受各种

3、理化因素的影响，加热、紫外线照射、机械振荡、酸碱和酒精等因素均可破坏补体。在-10活性保持34天，冷冻干燥可较长时间保持其活性，加热5630分钟灭活（灭能），故补体活性检测应尽快进行。标本保存应置于-20以下。二、补体的活化途径补体蛋白通常以活化蛋白前体存在于体液中，在不同激活物的作用下，补体各成分可循不同的途径依次被活化，形成一系列级联反应，表现出生物活性，最终导致溶细胞效应。1.经典途径：以抗原-抗体复合物结合C1q启动激活，是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式。2.MBL途径：是甘露聚糖结合凝集素（MBL）结合至细菌启动的途径。其诱导物或激活剂是机体的炎症反应急性期时相性蛋白产生的MB

4、L和C反应蛋白等，后者与病原体结合而启动绕过C1的MBL途径。3.旁路途径：是通过微生物表面等膜性物质，从C3开始，由B因子、D因子参与激活过程，也称第二途径、旁路途径。这种激活方式不依赖于特异性抗体的形成，在感染早期可为机体提供有效的防御机制。在机体抗感染过程中，首先活化和发挥作用的补体途径，是不依赖抗体的旁路途径和MBL途径。而在特异性抗体产生时，经典途径方可发挥作用。第二节补体总活性测定血清补体总活性的测定，是对激活后补体最终效应的检测方法，可借此反映补体的整体功能。以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，故称CH50。包括：基于经典途径的CP-CH50和应用于C3旁路检测的AP-

5、CH50。CP-CH50是临床常规进行的补体总活性检测项目。通常述及的CH50系指CP-CH50。一、CH50测定法的原理补体最主要的活性是溶细胞作用。特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀导致溶血。补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系。溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线。以溶血百分率为纵坐标，相应血清量为横坐标。S形曲线在30%70%之间几乎呈直线，即曲线此阶段对补体量的变化非常敏感。因此，实验常以50%溶血作为终点指标，它比100%溶血更为敏感，这一方法称为补体50%溶血实验，即CH50。二、CH50测定方法1.红细胞浓

6、度的调整2.溶血素滴定3.稀释缓冲液：磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液等均可用于溶血试验。4.50%溶血标准管：做CH50试验时，应同时配制50%溶血标准管。5.50%溶血总补体值的计算三、方法评价与临床意义CH50测定补体活性，方法简便、快速，虽敏感性较低，但可以满足对血清补体含量测定的要求。影响补体活性测定结果的因素较多，诸如反应所用的缓冲液、SRBC的数量和状态、反应温度、pH、离子强度以及反应容器的洁净程度等。该法主要检测的是补体经典途径的溶血活性，所得结果反映补体C1C9等9种成分的综合水平。如果CH50测定值过低或者完全无活性，应考虑补体缺陷；可再通过C4、C2、C3和C5等单个补体成分的

7、检测，区别是否因某一成分缺乏所致，以便做出确切的实验室诊断。严重肝病或营养不良时，由于蛋白合成障碍，引起血清补体水平的下降。而系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和强直性脊柱炎等自身免疫病患者，疾病活动期补体活化过度，血清补体因消耗增加而水平下降；病情稳定后补体水平又反应性增高。因此，补体检测常可用于自身免疫病的诊断，也可作为某些疾病活动期的参考指标。在细菌感染，特别是革兰阴性细菌感染时，常因补体旁路途径的活化而引起血清补体水平的过度降低；而心肌梗死、甲状腺炎、大叶性肺炎、糖尿病、妊娠等情况下，血清补体水平常见升高。第三节单个补体成分的测定C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物等，常被作为单个补体

8、成分的检测指标。常用免疫溶血法检测单个补体成分的活性；基于抗原抗体反应的血清学法（免疫化学法）测定其含量。目前应用自动化免疫散射比浊法可准确测定体液中C3、C4等多个单一的补体成分。一、免疫溶血法该方法中抗原为SRBC，抗体为兔或马抗SRBC的抗体（IgG、IgM型），即溶血素。试验中有两组补体参与，一组缺少待测成分的试剂（R试剂）。加入致敏SRBC（检测经典途径补体成分用）或兔红细胞RRBC（检测替代途径补体成分用）后，不发生溶血。另一组为待测血清中的补体，当加入待测血清，补体成分齐全，产生溶血。溶血程度与待测补体成分活性有关，仍以50%溶血为终点。采用免疫溶血法检测待测标本中某一单个补体成

9、分是否缺乏，可以帮助诊断补体某个成分缺失或其含量正常但无溶血活性的先天性补体缺陷。无需特异仪器与设备，快速，但敏感性较低，影响因素多。该法不是检测某补体成分的具体含量，而是检测其活性，在某些需了解该成分活性情况下，本试验适用。二、免疫化学法分为单向免疫扩散、火箭免疫电泳、透射比浊法和散射比浊法。后两种方法可通过仪器对补体的C3、C4、B因子等单个成分进行自动化测定。待测血清标本中的C3、C4成分，经适当稀释后与相应抗体反应形成复合物，反应介质中的PEG可使该复合物沉淀，仪器对复合物产生的光散射或透射信号进行自动检测，并换算成所测成分的浓度单位。该法是借助补体的抗原性和与相应抗体反应的前带原理建

10、立的补体单个成分定量检测法。利用前带原理必须以过量的抗补体抗体保证准确测定的质量。因其简单、特异、重复性好、自动化程度高而颇受使用者欢迎。自动免疫比浊法可反映所测补体成分的绝对量，并能进行标准化流程管理与质量控制，是目前国内外临床免疫检测中的主要检测方法。第四节补体结合试验（CFT）将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法。该方法并非用于补体的检测，而是利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定。一、试验原理包括反应系统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）；补体系统；指示系统：SRBC与相应溶血素预先结合，成为致敏绵羊红细胞。反应分两步进行。首先是反应系统

11、与补体的作用；第二步是指示系统利用剩余补体的反应。如反应系统中有抗体或抗原，则形成免疫复合物而固定和消耗补体，使后加入的SRBC-抗SRBS指示系统无多余补体可利用，则无溶血反应发生，反之亦然。不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性。试验中将反应系统的待测抗原（或抗体）作系列倍比稀释可作半定量测定。试验中以50%不溶血作为判断终点。二、试验方法（一）试剂的准备1.抗原或抗体2.补体：采用豚鼠血清为补体。3.待测标本：及时分离血清用于检测或-20保存备用。试验前，应先将血清56加热30分钟（或603分钟）以灭活补体。血清标本遇有抗补体现象时，可作下列处理：加热灭活时提高l2；-20冻融后离心

12、去沉淀；以3mmol/L盐酸处理；加入少量补体后再行灭活；以白陶土处理；通入CO2；以小白鼠肝粉处理；用含l0%新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清。（二）正式试验：小量法较为常用。三、方法评价补体结合试验是一经典的免疫技术，具有灵敏度高、可检测的抗原或抗体范围广泛等优点。该方法无需特殊设备，结果容易观察，试验条件要求不高，一般医院均具备开展的条件。第五节补体受体的测定补体受体存在于多种细胞，是清除免疫复合物、净化机体内环境的重要膜性成分。在若干补体成分中，C3是各活化途径的交汇点，且含量最多，故C3受体为测定的重点。第六节补体测定的应用补体的单个成分及总补体活性的测定，对于评价机体免疫功能、诊断与治

13、疗疾病、流行病学调查等均有重要的意义。同时，可根据补体的溶细胞活性和级联反应的性质，用于抗原或抗体的检测、免疫复合物的测定等。1.补体相关试验 用于诊断梅毒螺旋体感染的华氏反应（已淘汰）。2.补体含量和活性检测 反映总补体活性的CH50试验；用于检测补体单个成分及其裂解产物和补体受体的溶血试验、免疫化学试验和免疫荧光技术等。3.与补体含量和活性相关的疾病 主要包括：（1）免疫相关性疾病（2）与补体有关的遗传性疾病（3）高补体血症：偶见于感染恢复期和某些恶性肿瘤患者，如C2、C3、C4的升高。急性病毒性肝炎、心肌梗死、糖尿病甚至正常妊娠时，也可观察到补体值的增高。（4）补体含量显著降低的疾病：继

14、发性补体降低常见于下列情况：消耗增多，如SLE、冷球蛋白血症、自身免疫性溶血性贫血、类风湿关节炎、移植排斥反应等，此时因免疫复合物形成，消耗补体；补体的大量丢失，主要见于大面积烧伤患者、失血及肾脏病患者；补体合成不足，常见于肝脏疾病患者或营养不良的患者。此外，细菌（特别是G-）感染时，常因补体替代途径的活化使补体水平暂时降低。正确答案C答案解析补体总活性测定常采用的是CH50试验。正确答案C答案解析补体结合试验试验原理：包括反应系统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）；补体系统；指示系统：SRBC与相应溶血素预先结合，成为致敏绵羊红细胞。正确答案E答案解析免疫溶血法中抗原为SRBC，抗体为兔或马抗SRBC的抗体（IgG、IgM型），即溶血素。试验中有两组补体参与，一组缺少待测成分的试剂（R试剂）。加入致敏SRBC（检测经典途径补体成分用）或兔红细胞RRBC（检测替代途径补体成分用）后，不发生溶血。另一组为待测血清中的补体，当加入待测血清，补体成分齐全，产生溶血。溶血程度与待测补体成分活性有关，仍以50%溶血为终点。