2022年实验教学教案首页.docx

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1、精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载试验教学教案首页可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_本次试验项目：动物肝脏DNA的提取及检测可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_本次试验课时：10 学时试验类型：综合性教学要求：1把握试验原理2知道提取DNA 要去除的物质,各步操作要规范,能够提取出DNA .3把握琼脂糖凝胶电泳的试验操作技术重点：各步操作要规范,能够提取出DNA .能够用电泳方法检测出所提的DNA .教学手段及教具：课堂讲授,同学试验操作.讲授内容准时间安排：课堂讲授1相关学问0.1学时2试验目

2、的0.3学时3试验原理0.3学时4试验操作0.3学时试验教学动物肝脏DNA 的提取及检测试验的操作技术9学时参考资料分子生物学试验可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 1 页,共 6 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载综合性、设计性试验基本信息表学院名称生物科学与工程学院试验室名称生物化学试验室课程名称生物化学面对专业生物科学、生物技术大纲规定可编辑资料 - - - 欢迎下载精

3、品_精品资料_试验名称动物肝脏中 DNA 的提取及检测学时数10可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_试验性质 （） 综合性 设计性实开学时数10试验目的：依据老师供应的试验条件,明白并把握提取基因组 DNA 的原理和技术.能够从动物肝脏中提取 DNA 粗品, 并能够用琼脂糖凝胶电泳法检测所提 DNA .对试验结果做出正确定的分析.试验要求：实1 依据老师给预备的试验材料、试验仪器和试剂,结合试验目的进行整个试验过程在试验前做好预习.验2 做好每步试验结果的记录,依据原始记录,对试验结果做出正确分析,写好试验性报告.写出本试验胜利与失败的缘由.质试验内容：及第一部分：动物肝脏中DNA

4、 的提取依其次部分： DNA 琼脂糖凝胶电泳据认定依据： 本试验内容所涉及本课程综合学问包括以下几方面：1. 蛋白质变性作用、变性剂和酶的抑制剂.2. 细胞膜蛋白的裂解、核蛋白体的解离.3. EDTA 、SDS、蛋白酶K 的作用.4DNA的理化性质、 DNA 片段的大小表示方法、DNA 与染料分子EB 的结合.5. 琼脂糖凝胶浓度的挑选及配制.6电泳学问及影响电泳样品迁移率的因素.试验项目设计人签字：李敏2022 年 5 月 10 日可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_专家组认定看法职能部门意盖章年月日见盖章年月日学院看法专家组组长：年月日可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品

5、资料_可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 2 页,共 6 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载动物肝脏 DNA的提取及检测 （综合性）相关学问1蛋白质变性作用,变性剂和酶的抑制剂2 EDTA 、SDS、蛋白酶K 的作用、 DNA的理化性质：溶解特性影响电泳迁移率的因素核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度与DNA 分别范畴琼脂糖浓度0.30.60.70.91.21.52.0线

6、状 DNA大小 /kb5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分别的关系不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA 直线 DNA 开环的双链环状DNA . 琼脂糖凝胶电泳的特点自然琼脂 （ agar）是一种多聚糖, 主要由琼脂糖（ agarose,约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组 成.琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质, 不带电荷,而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖,由于这些基团带有电荷,在电场作用下能产生较强的电渗现象,加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分别成效.因此,目前多用琼脂糖为电泳支持物进行

7、平板电泳,其优点如下.琼脂糖凝胶电泳操作简洁,电泳速度快,样品不需事先处理就可以进行电泳.琼脂糖凝胶结构匀称,含水量大（约占 98%99%）,近似自由电泳, 样品扩散较自由电流,对样品吸附极微,因此电泳图谱清楚,辨论率高,重复性好.琼脂糖透亮无紫外吸取,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定.电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定.制成干膜可长期储存. 常用染料EB （溴化乙锭EthidiumBromide , EB ）：溴乙锭染料全名是3, 8-二氨基 -5- 乙基 -6-苯基菲啶溴盐,是诱变剂,可与核酸结合,在紫外光下呈黄色荧光.使用时肯定要戴手套.EB 废液要经过处理才能丢弃

8、.在 300nm 波长的紫外光照耀下发出荧光.在适当的下,荧光强度与DNA 片段的大小 或数量 成正比.可插入碱基与碱基之间造成移码突变.DNA （ RNA ）定量分析：可用紫外光谱 分析, 原理是 DNA （ RNA ）分子在 260 nm 处有 特 异 的 紫 外 吸 收 峰 , 且 吸 收 强 度 与DNARNA 的浓度成正比.此外, 仍可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的 DNA （ RNA ）带的亮度来分析, 由于 EB 作为一种荧光染料, 能插入 DNARNA 的碱基对平面之间而结合于其上,在紫外光的激发下产生荧光,DNARNA 分子上 EB 的量与 DNA 分子的长度和数量成正比.在电泳

9、时加入已知浓度的DNA （ RNA ） Marker 作为 DNA （ RNA ）分子量及浓度的参考,样品DNARNA的荧光强度就可以大致表示 DNA （ RNA ）量的多少. 提纯的思路基因组DNA 的特性：分子量较大、所提取的DNA 片段的大小： 100 150kb,易断（如何可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 3 页,共 6 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载保证 DN

10、A 分子的完整性？）组织和细胞的破裂要去除的物质：蛋白、多糖、脂类、RNA 和小分子物质第一部分动物肝脏 DNA 的提取一、试验目的通过本试验明白并把握提取基因组DNA 的原理和技术.二、试验原理在 EDTA 和 SDS 等去污剂存在下,用蛋白酶K 消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳动物基因组DNA ,用此方法得到的DNA 长度为 100 150Kb ,适用于 Southern 杂交、基因组 DNA文库的构建,酸性条件下DNA 溶于有机相.碱性条件下（78 以上）溶于水相.三、试验仪器、材料和试剂材料：鸡肝试剂：1 5mol/LNacl2 0.5 mol/L Tris.HClpH8.0 3

11、0.5 mol/LEDTApH8.0 4 3mol/LNaAcpH5.2以上均高压灭菌5 蛋白酶 K ： 10mg/ml 配好后用一次性过滤器过滤,20 度储存6 组织匀浆液100mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris.HCl （pH8.0 ）,25mmol/LEDTA（pH8.0 ）7 酶解液： 200mmol/L NaCl,20mmol/L Tris.HCl （ pH8.0 ）,50mmol/LEDTA（ pH8.0 ）,200ug/ml 蛋白酶 K , 1%SDS.8 无 DNA 酶的 RNA 酶：将胰 RNA 酶溶于 100 mmol/L Tris.HCl （ pH7.5

12、 ）、15 mmol/L NaCl溶液中,浓度10mg/ml ,于 100 度水浴处理15 分钟以降解DNA 酶,缓慢冷却到室温, 20 度储存.9 TE 缓冲液10mmol/L Tris.HCl （ pH8.0 ）, 1 mmol/LEDTA （pH8.0 ）10平稳酚（ pH8.0 ）：氯仿：异戊醇25： 24：1（体积比）10. 氯仿：异戊醇24： 1（体积比）11. 5 TBE 5.4gTris, 2.75g 硼酸, 2ml 0.5 mol/LEDTA（pH8.0 ）,加水到100ml12. 6 上样缓冲液0.25% 溴酚蓝, 40%（ W/V ）蔗糖水溶液13. DNA相对分子质量标

13、准片段（bp）.四、试验操作步骤0.3g （0.2g ）鸡肝,（冰冷生理盐水洗3 次）,剪碎 速度要快 碎鸡肝转入预冷的玻璃匀浆器中,加入2mL匀浆液（含EDTA）,匀浆（ 低温操作 ,至少 56 次,直到 无大块的组织存在）匀浆液转入2mL小离心管 （转管前先静置一会,防止未碎的大块的组织进入2ml 管）04 C , 5000rpm离心 12min （离心要平稳,对称）弃上清,沉淀（细胞）加0.4mL 无菌水, 用枪吹散 ,再加 0.4mL 酶解液（含SDS、蛋白酶 K）渐渐 颠倒混匀,可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -

14、第 4 页,共 6 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载55 水浴酶解 2-3 小时,直到 酶解液完全清亮0（加 RNase , 终浓度 200ug/mL, 37 C 保温 60min, 可省略）0加等体积酚 / 氯仿,（取下层液 ） 渐渐 颠倒混匀,冰上平倒静置10min 4 C, 10000rpm 离心 10min试管中液体分三层：水相、蛋白层、有机相用钝化枪头 当心 取出上清水相（水相中含有DNA丝状粘稠）入另一新1.5 小试管中留意不要取到蛋

15、白上清加 1/10 体积的 3mol/L NaAc （ pH5.2？）和 2 倍体积的无水乙醇渐渐 混匀,冰上（-20 ）静置 30min 以上（析出DNA,观看丝状物）04 C, 8000rpm 离心 10min沉淀用 1mL 70%冷乙醇洗1-2 次,每次 8000rpm 离心 10min,弃上清离心管中开盖,超净台中干燥沉淀加 20 -100uL TE, 40C溶解（可依据沉淀量确定加TE的量）问题：各步操作所用试剂的作用及结果现象？操作方法留意事项？其次部分DNA 琼脂糖凝胶电泳一、试验目的通过本试验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的方法和技术.二、试验原理DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电

16、荷效应和分子筛效应.核酸为两性分子,在PH3.5 时,整个分子带正电.PH8 左右时,碱基几乎不解离,整个分子带负电.在碱性环境下,不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构, 几乎具有相同的电荷密度, 相同碱基数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动.在肯定的电场强度下, DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应即 DNA 分本身的大小和构型. 具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样,可进行分别.三、仪器、材料与试剂（一） 仪器可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 5 页,

17、共 6 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载电泳仪、平板电泳槽、样品槽模板（梳子）、橡皮膏、锥形瓶（100ml 或 50ml ）、紫外分析仪、照相机或凝胶自动成像仪、一次性塑料手套、Eppendorf 管（ 1.5ul ）、微量移液器、量筒、微波炉.（二）材料自已提取的DNA ,相对分子质量标准品（三）试剂1 5TBE 储液 PH8.0每升含 Tris54g ,硼酸 27.5g ,0.5mol/LEDTA20ml ,使用时稀释10倍成 0.5 TBE

18、 （ 1TBE 也可）.2 6凝胶加样缓冲液0.2%溴酚蓝, 50%蔗糖, 10mol/LNaOH12 滴,调至蓝色. 10mg/ml 溴化乙锭溶液（EB）,4储存.用时稀释成0.5ug/ml的 EB.四、试验操作步骤1琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提DNA的大小来确定,0.8%）配 0.8%的胶,称到肯定量的琼脂糖,放入锥形瓶中,加入25ml0.5 TBE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全溶化取出摇匀,得肯定浓度.等琼脂糖凝胶溶液冷却至50.加入EB液（ 3ul ,原液 10mg/ml ）.2. 凝胶板的制备3加样（样品总体积在1030ul ）待测 DNA中和 DNA标准样品中分别加入1/5

19、 体积的溴酚蓝指示剂, 混匀用移液器加入加样孔.4. 电泳电压挑选为80120/cm ,溴酚蓝移动到距胶板正极端约1cm 时停止电泳.5. 结果观看在 254nm紫外光灯下（ 300nm紫外灯下）五、试验结果与争论1依据观看结果,按比例绘出凝胶图谱,并注明观看到的DNA亮带.2判定所提DNA是否完整,假如断裂或者弥散,分析是在哪些步骤显现的问题.3.提 DNA及电泳过程都遇到哪些问题,有哪些是在操作中应当留意的.六、留意事项摸索题1. 各步骤及所加试剂的作用及结果现象2核酸的变性？核酸的理化性质可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 6 页,共 6 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载