银杏内生真菌次生代谢产物及其促进小麦 抗低温活性研究，李红霞.docx

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1、 METABLITES OF ENDOPHYTIC FUNGI FROM GINKGO BILOBA AND THEIR BIOACTIVITY IN INCREASING TOLENRANCE TO CHILLING INJURY OF WHEAT SEEDLINGS By Hongxia Li A THESIS Submitted to Nanjing Agricultural University In Partial Fulfillment of the Requirements For the Master Degree of Science Supervised by Prof.

2、Yonghao Ye Department of Pesticide Science College of Plant Protection Nanjing Agricultural University Nanjing 210095 P. R. China May 2013 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 本学位论文作者完全了解学

3、校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 保密 , 在 _ 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密 0。 (请在以上方框内打 “ V ） 学位论文版权使用授权书 摘 g . I ABSTRACT . Ill 缩胃 . V 上 篇 文 献 综 述 第一章植物内生真菌及其与宿主互作关系 . 1 1 内生真菌的定义 . 1 2 内生真菌的分布特点 . 1 3 内生真菌与宿主植物的互作关系

4、. 2 3.1 内生真菌对宿主植物的促生作用 . 3 3.2 内生真菌提高宿主植物的抗逆性 . 3 4 小结与展望 . 7 第二章脑苷脂类化合物的生物学活性 . 9 1 抗菌杀虫活性 . 9 2 植物生长调节活性 . 10 3 抗肿瘤活性 . 11 4 细胞毒性 . 14 5 其他活性 . 15 6 猶 . 17 下 篇 研 究 内 容 第三章银杏内生真菌分离及 TP78 代谢产物研究 . 19 1 材料与方法 . 19 1.1 材料 . 19 1.2 银杏内生真菌分离与初步分类 . 20 1.3 目标菌株确定及菌种鉴定 . 21 1.4 菌株 TP78 固体发酵与分相萃取 . 22 1.5

5、菌株 IT78 发酵产物分离纯化及结构鉴定 . 22 2 结果与分析 . 23 2.1 银杏内生真菌分离和初步分类 . 23 目录 银杏内生真菌次生代谢产物及其促进小麦抗低温活性研究 2.2 目标菌株确定及菌种鉴定 . 24 2.3 菌株 TP78 固体发酵产物分离纯化 . 26 2.4 脑苷脂类化合物结构鉴定 . 26 第四章脑苷脂 C 对小麦形态及生理生化特征的影响 . 31 1 材料和方法 . 32 1.1 #14 . 32 1.2 小麦种子萌发试验 . 32 1.3 小麦幼苗生长试验 . 33 1.4 小麦幼苗 /根系 MDA 含量和 CAT 活性的测定 . 33 1.5 低温胁迫下小

6、麦根系细胞膜损伤相关指标的测定 . 33 1.6 低温胁迫下小麦根系脂肪酸含量的测定 . 35 1.7 低温胁迫下小麦根系抗氧化酶活性的测定 . 35 1.8 低温胁迫下小麦根系胞内调节物质的测定 . 37 1.9 数据处理 . 37 2 结果与分析 . 37 2.1 脑苷脂 C 对低温胁迫下小麦种子萌发的促进作用 . 37 2.2 脑苷脂 C 对低温胁迫下小麦幼苗和根系生长的影响 . 39 2.3 脑苷脂 C 对低温胁迫下幼苗 /根系 MDA 含量和 CAT 活性的影响 . 41 2.4 脑苷脂 C 对小麦根系细胞膜损伤指标的影响 . 42 2.5 脑苷脂 C 对低温胁迫下小麦根系脂肪酸种类

7、及其含量的影响 . 45 2.6 脑苷脂 C 对低温胁迫下小麦根系抗氧化酶系活性的促进作用 . 48 2.7 脑苷脂 C 对低温胁迫下小麦根系胞内调节物质含量的影响 . 50 3 小结与讨论 . 51 3.1 脑苷脂 C 对小麦根系膜损伤指标的影响 . 51 3.2 脑苷脂 C 对小麦根系脂肪酸不饱和度的影响 . 52 3.3 脑苷脂 C 对小麦根系抗氧化酶活性的影响 . 53 致雜 . 55 #教 # . 57 附录一菌株 TP78 的 ITS 序列测定结果 . 67 附录二化合物 1 和 2 的波谱数据 . 69 硕士期间发表论文及申请专利 . 73 . 75 摘要 银杏内生真菌次生代谢产

8、物及其促进小麦 抗低温活性研究 摘要 植物内生真菌与宿主协同进化，在宿主生长发育和抗逆过程中可代谢产生具有抗 菌、杀虫、植物生长调节等重要活性的物质，对宿主发挥着重要的生态学作用。本研 究从银杏中共分离到 80 株内生真菌，经形态学进行初步分类，采用 iH-NMR筛选方 法发现一株产脑苷脂类化合物的菌株 TP78， 经鉴定为叶点霉菌 sp.， GenBank登录号： KC445736)。对菌株 TP78 进行固体发酵，分离纯化代谢物得到两 个脑苷脂类化合物，综合 NMR和MS 波谱数据鉴定为脑苷脂 B (cerebroside B)和 脑苷脂 C (cerebrosideC)。 并以小麦（ T

9、hT/cM/waesrtvMwcv. Huaimai25)为试验材料， 研究脑苷脂 C促进小麦抗低溫活性及其作用机制。 脑苷脂 C对 4 C低温胁迫下小麦种子萌发（种子发芽率、萌发芽、发芽指数和平 均发茅天数）的试验，结果表明： （ 1)脑苷脂 C在不同浓度下（ 5、 10、 20、 50 pg/mL) 均可提高小麦种子萌发率、萌发势和种子活力指数，并降低种子平均萌发天数； （ 2) 在处理浓度为 20 ng/mL 时，促生效果显著，其中发芽率、发芽势、发芽指数分别达 到 77.80%、23.46%、 3.44,显著高于对照， “ 平均发芽天数为 6.19d， 显著低于对照。 脑苷脂 C对 4

10、C 低温和 25C 常温处理下小麦幼苗 /根系生长（根长和芽长、根鲜 重和茅鲜重、根干重和芽鲜重）的试验，结果表明： （ 1)在 25C 常温下，脑苷脂 C 对小麦幼苗 /根系生长均无明显作用，而在低温胁迫下具有促进小麦根系生长、提高根 系干物质积累的作用； （ 2)脑苷脂 C可显著提高 4C 低温处理下根系组织内过氧化氫 酶 （ CAT)活性 并降低丙二醛 （ MDA)含量，而对幼苗相关生理指标无明显作用。 脑苷脂 C对小麦根系生理生化指标随低温胁迫时间（低温处理 Oh、 6h、 12h、 24h、 48 h、 72 h及恢复 25C 24 h)的变化试验，结果表明： （ 1)脑苷脂 C可有

11、效抑制低温 胁迫下根系生物膜脂过氧化物 MDA的积累，降低根系细胞膜的通透性（相对透性 RMP)，从而防止胞内保护物质的大量外渗； （ 2)脑苷脂 C可有效抑制小麦根系脂氧 I 银杏内生真菌次生代谢产物及其促进小麦抗低温活性研究 合酶 （ LOX)、 磷脂酶 C (PLC)和磷脂酶 D (PLD)的活性，从而抑制磷脂分子和不 饱和脂肪酸的水解； （ 3)脑苷脂 C 促进小麦根系不饱和脂肪酸的积累，提高根系脂肪 酸不饱和度，降低膜的相变溫度，防止低温对细胞膜结构的破坏。 （ 4)脑苷脂 C 在一 定程度上提高小麦根系超氧化物歧化酶 （ SOD)、 过氧化氩酶 （ CAT)和谷胱甘肽过 氧化物酶（

12、 GSH-Px)的活性，保栌细胞膜免受氡化损伤； （ 5)脑苷脂 C 促进小麦根 系胞内调节物质（可溶性糖和可溶性蛋白）的积累，从而增加细胞膜渗透调节能力。 综上所述，本研究通过对产脑苷脂类化合物的银杏内生真菌 PAy/o 劝 sp. TP78 研究发现，其次生代谢产物脑苷脂 C 可以提高小麦抗低温胁迫的能力，其作用机制为 脑苷脂 C 可維持低温胁迫下小麦根系细胞膜结构完整性和功能稳定性。 关键词：银 杏内生真菌；脑苷脂 C;低温胁迫；生理生化指标 ABSTRACT METABLITES OF ENDOPHYTIC FUNGI FROM GINKGO BILOBA AND THEIR BIOA

13、CTIVITY IN INCREASING TOLENRANCE TO CHILLING INJURY OF WHEAT SEEDLINGS ABSTRACT Co-evoluting with host plants, endophytic fimgi play an important ecological role in growth and resistance process of host plants due that they can metabolize large amounts of substances with various biological activitie

14、s including antibacterial, insecticidal and plant growth regulation and other important activities. In our study, 80 strains from Ginkgo biloba L. were obtained and priliminarily classified based on morphological characters. Cerebrosides-producing strain TP78 Phyllosticta sp., GenBank: KC445736) wer

15、e selected using chemical method of H-NMR and studied subsequently. By solid-state fermentation, cerebroside B and cerebroside C were yieleded from the crude extracts of TP78. We also study the promotion and mechanism of cerebroside C on increasing tolenrance of wheat seedlings (Triticum aestivum cv

16、. Huaimai 25) under low temperature. Researching in promoting of cerebroside C (CC) on seed germination showed that CC improved seed germination at different concentration (5， 10, 20， 50 (ig/mL) under cold stress. The results also demonstrated that CC treatments at 20|ig/mL expressed the highest ger

17、mination rate (77.80 %)3 potential (23.46 %)? index (18.51) and the shortest germination time (7.08 d)3 displaying significant differences between CC-treatments and the control groups. After comparing the different effects of CC between at 40C stress and 25C on the seedlings growth through mansuatti

18、ng root length, shoot height and their fresh / dry weight, results were discovered as follows: (1) CC had few effects on neither shoots or roots of wheat seedlings at room temperature but promoted root growth and increased dry substance accumulation in roots under cold stress; (2) CC had a major rol

19、e in root growth and dry matter accumulation in roots of wheat seedlings; (3) CC enhanced the enzyme activity of catalase (CAT) and decreased the content of lipid peroxide malondialdehyde (MDA) in roots, with few effects on the indicators in shoots. Researching on the changes in physiological and bi

20、ochemical characteristics in roots of wheat showed that (1) cerebroside C decreased membrane relative permeability (RMP) and HI 银杏内生真菌次生代谢产物及其促进小麦抗低温活性研究 inhibited accumulation of MDA in root to prevent intracellular protective materials from extravasating; (2) CC inhibited the activities of lipoxyg

21、enase (LOX)， phospholpase C (PLC), phospholpase D (PLD), which are on behalf of disassembling phospholipid and unsaturated fatty acid to maintain the structural integrity and functional stability of cell membrane; (3) CC induced accumulations of unsaturated fatty acids to increase the degree of unsa

22、turated fatty acids, thereby reducing the phase transition temperature of membrane and alleviating membrane damage; (4) CC increased the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in roots, protecting cell membrane from oxidative damage; (5) CC promo

23、ted the accumulation of intracellular substances soluble sugar and soluble protein in roots, thus increasing membrane osmotic adjustment ability. In summary, the metabolite of cerebroside C isolated from the endophytic Phyllosticta sp. (TP78) in gikgo biloba could increase tolenrance to chilling inj

24、ury of wheat seedlings through maintaining the structural integrity and functional stability of root membrane. KEY WORDS： Endophytic fungi in gingkgo biloba; Cerebroside C; Chilling stress; Physiological and biochemical indicators IV 缩 略 语 缩略语 缩写 英文名称 中文名称 CC Cerebroside C 脑苷脂 c CC+4C Treatmets unde

25、r cold stress 低温处理组 CK+4C Control under cold stress 低温对照组 CC+25C Treatmets under room temprature 常温处理组 CK+25C Control under room temprature 常温对照组 SOD Superoxide dismutase 超氧化物歧化酶 CAT Catalase 过氧化氢酶 GSH-Px Lutathione peroxidase 谷胱甘肽过氧化物酶 POD Peroxidase 过氧化物酶 MDA Malondialdehyde 丙二醛 RMP Relative membr

26、ane permeability 膜相对透性 LOX Lipoxygenase 脂氧合酶 PLC Phospholpase C 磷脂酶 C PLD Phospholpase D 磷脂酶 D FAME Fatty acid methyl esters 脂肪酸甲脂 ELISA Enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附测定 GC-MS Gas chromatography - Mass spectrum 气相色谱 -质谱联用仪 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 V t 篇文献综述 第一章植物内生真菌及其与宿主互作关系 第一章植物内生真

27、菌及其与宿主互作关系 植物内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，在与宿主植物共同进化过程中 形成互利共生的关系，对宿主植物在生长发育、抗逆境、抗病虫害等方面发挥着重要 的生态学作用 （ Czamoleskie/d.,2012)。 内生真菌可产生丰富多样的次生代谢产物， 具有多种生物学活性，包括抗菌、杀虫、植物生长调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒和 免疫调节等重要活性 （ Gutierrezef 虬， 2012),目前对植物内生真菌及其天然次生代谢 产物结构和功能的研究已成为天然产物研究领域的热点之一。 1 内生真菌的定义 早在 19 世纪中叶， De Baiy (1886)最先提出植物内生菌一词

28、 “endophyte ， 指 的是生活在植物组织内部的微生物，以区别于植物表面的表生菌。目前，植物内生真 菌（ endophytic firngi)泛指一切生活在植物体内的腐生、寄生和共生真菌，这类微生 物在其生活史的全部阶段或一定阶段生活于健康植株的各种组织或器官内部，且宿主 植物不表现出明显的外在病症，可以通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中 分离或从植物组织内直接扩增出微生物 DNA (Araujo e/虹， 2001)。 1898 年 Vogl 从 黑麦草 lo/iMwL.种子中分离出第一株内生真菌，随后的几十年，很少有 研究者涉足这一 领域。直到 80 年代初期，人们才开始关

29、注植物内生真菌的作用，研 究者对内生真菌的研究也不仅仅局限在牧草植物上，开始研究内生真菌的多样性和生 物学作用以及和宿主植物的关系。但是由于当时技术条件和理论依据的限制，对植物 内生真菌的研宄仍较为浅显。 Stierle 于 1993 年，首次从短叶红豆杉 （ r ms6revz 为 a) 的軔皮部分离到一株安德氏紫杉霉 （ raxomjceiawdreanae)， 可代谢产生具有抗肿瘤活 性的紫杉醇 （ Taxol),从此掀开了人们对植物内生真菌及其活性代谢物质研究与开发 的热潮（ Catalina 以 a/.， 2007 )。 2 内生真菌的分布特点 植物内生真菌是一个生态学概念，在长期的

30、生物进化中与宿主植物和谐的生活在 一起，在植物的生态系统中具有非常重要的生态和生理作用 （ Czamoleskie/a/.,2012)， 具有分布广泛、种类繁多、寄生专一而且极易变异等特点，是一个多样性十分丰富的 生 物 类群。内生真菌大多数属于子囊菌类的核菌纲 （ jFyenomyefey) 、 盘菌纲 （ ) 和 腔 菌 纲 （ ZocM/ ooycowje/es ) ， 少 数 属 于 担 子 菌 类 银杏内生真菌次生代谢产物及其促进小麦抗低温活性研究 和卵菌类（ Wj)内生真菌中分离得到对白 色 斑 点 椿 象 （ 办 * ；汾 ) 有 明 显 趋 避 作 用的化合物 3-(4-met

31、hylfiiran-3-yl)propan-l-ol: Findlay 和 Sumarah 等人 （ 2003; 2008; 2009)从云 杉等针叶乔木内生真菌代谢产物中发现一系列具有杀虫活性的物质：如从香脂冷杉 中分离到一株内生菌，在其发酵产物中分离出 2 个二蔽类化合物： 9a-hydroxy-1,8(14), 15-isopimaratrien-3, 7, 11-trione)和 9a-hydroxy-l, 8(14), 15 七+111 1； 11611-3,11-11 1，它们对揪色卷蛾的胃毒致死率分别为 28%和 32/ ; 从黑云杉和白云杉 （ P/ceag/awca)内生真菌

32、液体发酵物中分离到多 个云杉礙虫 （ *Sn/ce6w/viww)有明显的毒性聚酮类化合物。 6 上 篇 文 献 综 述 第一章植物内生真菌及其与宿主互作关系 4 小结与展望 由于长期生活在植物体内特殊的环境中，植物内生真菌与宿主协同进化，在宿主 生长发育和抗逆过程中合成多种结构新颖的次生代谢物质 （ Ge and Tan， 2009; Zhang e/1 a/.，2006)，这些活性物质在增强宿主植物对环境胁迫的抗性 （ Pennisi， 2003)、抵御 有害生物侵袭 （ Wallere/fl/.， 2005)等方面发挥着重要的生态学作用，多数具有抗菌、 杀虫、植物生长调节、抗氧化、抗病毒

33、等多种重要生物活性 （ GutierreZeffl/.， 2012)。 植物内生真菌对宿主植物生长发育和抗逆生理方面的重要作用，以及其合成的多 种结构新颖的次生代谢物质使得内生真菌在农业上的应用具有更广阔的发展潜力。目 前对植物内生真菌及其次生代谢产物结构和功能的研宄已成为世界范围的热点领域， 植物内生真菌合成的多种结构新颖、活性丰富的次生代谢物质是研制生物源农药或新 农药先导化合物的重要来源。 上 篇 文 献 综 述 第二章脑苷脂化合物的生物学活性 第二章脑苷脂类化合物的生物学活性 脑苷脂 （ cerebrosides)又称酰基鞘氨醇六碳糖苷，主要是由糖基、鞘氨基醇和酰 胺类的长链脂肪酸组成

34、，主要分布于动物组织、真菌、高等植物及一些海洋生物中， 最早是 Ttmdichmn于 1874 年从动物脑组织中分离得到的，是神经鞘脂类的一种，属 于中性鞘糖脂，是细胞膜结构的重要组成成分 （ Runuana and Martin， 1995)。这类化合 物的神经酰胺长链结构上多存在不饱和双键，依据其结构特点，脑苷脂类化合物分为 葡糖脑苷脂 （ glucocerebroside， GlcCer)、 半乳糖脑苷脂 （ galactocerebroside， GalCer) 和胆碱磷酸脑苷脂三类（桑已曙等， 2000)。 近几年研宄发现，脑苷脂类化合物作为细胞膜上抗原和病毒、细菌及毒素的受体 ,

35、在细胞识别、细胞分化、细胞粘合、细胞骨架的迁移、跨膜信号转导等方面发挥重要 的调节功能 （ Catenaa/.， 2003)，此外，脑苷脂及其衍生物还具有其它多方面的生物 学活性，包括抗菌抗病 毒、抗肿瘤、抗 HIV、 抗肝毒、调控细胞生长和免疫调节等重 要生物活性（ Kurosu 故 /.， 2007; Zigmond ef a/., 2007)。 1 抗菌杀虫活性 据报道，脑苷脂类化合物具有抗菌杀虫活性， Chen等 （ 2003)从半夏（乃 從 /此 中分离的新的脑苦脂类化合物半夏苷 （ pinelloside)对枯草芽孢杆菌 swAft/isO、 金黄色葡萄球菌 （ iSto/却 /o

36、cocciflMretAS) 、 黑 曲 霉 菌 及 白色念珠菌(CancMz 都有一定的抑制作用， MIC分别为 20、 50、 30、 10 ng/mL。 图 2-1 半夏苔 （ pinelloside)结构 Figure 2-1 Structure of pinelloside Wang 等 （ 2009)从一株海洋真菌 sp.发酵液中分离到 3 个脑苷脂类化 合物altemariaA-C (图 2-2)，三者对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌都有一定 9 银杏内生真菌次生代谢产物及其促进小麦抗低温活性研究 的抗菌活性，最低抑制浓度在 70 (imol/L 到 400 (imol/L。

37、 图 2-2 AltemariaA-C 的结构 Figure 2-2 Structures of altemaria A-C Shu 等 （ 2 0 0 4 ) 从 栓 皮 栋 内 生 真 菌 IFB-121 (Fwarfwmsp.) 代谢物中分离到三个脑苷脂化合物，发现其对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、荧光假单胞 菌具有较好的抑制活性； Umemura 等 （ 2000)和张永刚等 （ 2010)分别从植物病原 菌丝核菌 （ 7?/w_zoctoofasp.)、 水 稻 稻 瘟 病 菌 和 真 菌 Pflecf/omyces sp.中分离到脑苷脂 A 和脑苷脂 B， 具有较好的毒杀松材线虫 （ B

38、iwap/je/ewc/mj1 的活性，其中脑音脂 A 在质量浓度为 100 pg/mL 下对松材线虫的致死率达 100 %。张炜玲 （ 2010)首次从楝树内生真菌中分离的脑苷脂 B,也报道其具有抗菌 杀虫活性。 2 植物生长调节活性 Ishii 等 （ 2006)发现来源于海星代谢物的脑苷脂 asteriacerebrosides A, B and G(图 2-3)可促进油菜 cawipes/rfi1 L.)幼苗生长，与对照相比，幼苗生长率分别 提高 132、131、 116%，同时 ， asteriacerebrosides A 还能显著促进油菜幼苗根系的生 长。 Koga (1998)

39、和 Kenji (2004)分别发现脑苷脂 C 可诱导水稻植保素的合成和番 茄PR 蛋白的表达，激发水稻和番茄自身的防卫反应来有效抵御水稻稻瘟病菌和枯萎 病菌的侵染，从而提高水稻和番煎抗生物胁迫的能力。此外 ， Tan and Chen (2003) 研究报道脑苷脂类化合物可诱导水稻抗毒素和致病相关蛋白的合成，调节细胞的生长 并刺激细胞形态的变化。 10 上 篇 文 献 综 述 第二章脑苷脂化合物的生物学活性 Wang等 （ 2007,2009)研宄表明，脑苷脂 C可诱导悬浮细胞中苯丙氨酸解氨酶的 活性，并通过促进一氧化氮的产生来调节云南红豆杉悬浮细胞中紫衫醇的合成和青蒿 毛发根中青蒿素的生物

40、合成，同时促进药用植物红豆杉悬浮细胞的生长和黄花蒿根系 的生长。 另外，研发现一些脑苷脂类化合物与植物的抗寒性有关。 Kawaguchi等 （ 2000) 在研究葡萄树的某些种时发现，植物体内 4-轻基 -8-鞘氨醇的含量和其耐寒性密切相 关，抗寒能力较强的葡萄树中含这类结构的脑苷脂含量较高，这种现象在发育成熟的 青椒和番茄中也有发现 （ Whitaker, 1996)。 图 2-3 AsteriacerebrosideA、 B、 G 的化学结构 Figure 2-3 Structures of asteriacerebroside A9 Bs G 3 抗紳瘤活性 Chen等 （ 2009)是

41、从白子菜 （ Gjm/ra 必 vflrfiYrffl)中分离到的一种新的具有很强 细胞毒性的脑苷脂类化合物 gynuraoside， 可显著抑制小白鼠白血病肿瘤细胞 L1210 的生长。Cateni等 （ 2010)等从大戟属 （ p/iorWa/je/j/ivL.)分离到两种新的脑苷脂物 质，对人体肿瘤细胞 KB 和 IMR-32 有显著的抗增殖作用。 银杏内生真菌次生代谢产物及其促进小麦抗低温活性研究 图 2-4 Gynuraoside 的化学结构 Figure 2-4 Structure of gynuraoside 图 2-5 大 戟 属 中 脑 苷 脂 类 化 合 物 的 结 构 Figure 2-5 Struct