银杏树内生真菌代谢产物中 活性成分的研究，易大为.docx

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1、 沈 阳 药 科 大 学 硕 士 学 位 论 文 银 杏 树 内 生 真 菌 代 谢 产 物 中 活 性 成 分 的 研 究 研 究 生 姓 名 ： 易 大 为 所 学 专 业 ： 微 生 物 与 生 化 药 学 指 导 教 师 ： 何 建 勇 教 授 白 秀 峰 教 授 2003年 6 月 银 杏 树 内 生 真 菌 代 谢 产 物 中 活 性 成 分 的 研 究 单位：沈阳药科大学 代码 ： 10163 姓名：易大为 所学专业：微生物与生化药学 学位类别：硕士 指导教师：何 建 勇 教 授 白 秀 峰 教 授 评阅人： 学位论文完成日期： 2003年 6月 答辩委员会主席： 答辩时间： 计

2、 ： 学 位 论 文 89页 表格 17个 插图 9 幅 沈阳药科大学硕士学位论文 银杏树内生真菌代谢产物中活性成分的研究 申请学位级别：理学硕士 专业名称 . 微生物与生化药学 论文提交日期： 2003. 5. 30 论文答辩日期： 2003. 6. 16 THESIS FOR MASTER DEGREE OF SHENYANG PHARMACEUTICAL UNIVERSITY STUDY ON ACTIVE COMPONENTS OF METABOLITES FROM ENDOPHYTIC FUNGUS OF GINKGO BILOBA L. Major: Microbiological

3、 and Biochemical Pharmacy Name: Yi Dawei Tutor: Prof. He Jianyong Prof. Bai Xiufeng June， 2003 沈阳药科大学硕士学位论文 目录 目录 m . 1 ABSTRACT . 2 . 3 mm . 4 实验材料与方法 . 18 实验结果 . 24 1. . 菌种的分离纯化与鉴定 . 24 2_实验出发菌株的筛选 . 28 2.1菌体代谢物在 TLC上层析行为的考察 . 28 2.2菌体代谢物在 HPLC上保留行为的考察 . 29 2.3 HPLC分析基础上的质谱解析 . 31 2.4应用 HPLC/ESI-M

4、S法对菌体代谢物中活性成分的检测 . 34 3. 分离提取部分 . 36 3.1内生真菌胞内产物的浸提 . 36 3.2菌丝体粗提物的液液萃取 . 38 4. 银杏树内生真菌抗菌活性物质的筛选 . 43 5. 化合物 H-3A的结构测定和光谱解析 . 48 6. 环肽类抗生素 Enniatins的研究概况 . 50 结论 . 52 W it . 53 参考文献 . 55 P付 60 iH . 89 沈阳药科大学硕士学位论文 摘要 摘要 内 生 真 菌 长 期 生 活 在 植 物 组 织 内 部 ，与 宿 主 协 同 进 化 ，在 演化 过 程 中 二 者 形 成 了 互 惠 共 生 的 关 系

5、 ， 在 宿 主 的 生 长 发 育 和 系统 演 化 过 程 中 起 重 要 作 用 。 内 生 真 菌 可 产 生 一 些 重 要 的 治 疗 人类 疾 病 的 药 物 ， 对 内 生 真 菌 次 级 代 谢 产 物 的 研 究 ， 可 以 筛 选 得到 一 些 结 构 新 颖 、 活 性 专 一 的 物 质 。 本 文 以 银 杏 树 内 生 真 菌 (Endophytic fungus of Ginkgo biloba L., EG)为 研 究 对 象 ， 通 过 对 内 生 真 菌 胞 内 产 物 的 研 究 ， 定 向 筛 选 银杏 内 酯 产 生 菌 。 首先，从原始菌种 EG3

6、出 发 ， 在 筛 选 过 程 中 分 离 得 到 菌 株 G3-1、 3a、 G3b、 GAR、 GAY、 F卜 3 和卩 3 ，其 中 菌 株 kb、 GAR、 GAY、 Fp3 和 F3 经 菌 种 鉴 定 ，被 归 属 为 半 知 菌 亚 门 、丝 孢 纲 、瘤 座 孢 目、瘤 座 孢 科 、 镰 孢 菌 属 入 应 用 高 效 液 相 色 谱 法 和 电 喷 雾 质 谱 法 以 及 液 相 质 谱 联 用 技术 ，以 银 杏 内 酯 标 准 品 为 对 照 ，对 G3 系 列 菌 株 的 胞 内 产 物 进 行 了筛 选 和 检 测 。 由 检 测 结 果 初 步 认 定 ， 菌 株

7、 G3 b和 F3 的代 谢 产 物 中含 有 银 杏 内 酯 A、 银杏内酯 B和 白 果 内 酯 。 在菌株 Fps的 发 酵 液 中 ，检 测 到 有 抗 革 兰 阳 性 菌 的 物 质 存 在，通 过 对 活 性 成 分 的 追 踪 ， 分 离 得 到 化 合 物 F1-3 A和 F1-3B。 经 过 质 谱 、 1 H谱、 13C谱 以 及 二 维 核 磁 共 振 波 谱 的 测 定 和 解 析 ， 确定化合物 F1-3A的 分 子 结 构 为 ： cycloHiv-Me-Val-Hiv-Me-Val-Hiv-Me-Val;质 谱 、 谱 及 13C 谱 的 数 据 与 环 肽 类

8、抗 生 素 Enniatin B的 文 献 值 基 本 一 致 ， 认 定 二 者 同 质 。 经 过 质 谱 测 定 和 解 析 ， 化合物 F1-3B可 能 与 Enniatin Bi 或 Enniatin D 同质。 关 键 词 ： 内 生 真 菌 ， 筛 选 ， 银 杏 内 酯 ， 镰 孢 菌 ， 环 肽 沈阳药科大学硕士学位论文 ABSTRACT ABSTRACT There exists symbiosis between Endophytic fungus of plants and their hosts, now that Endophytic fungus live in

9、botanical tissues for a long period of time, and evolve together with their hosts. Endophytic fungus play important roles in the growth and evolution of plants, and many of them can produce some compounds with novel structure and specific bioactivity. In this paper, Endophytic fungus of Ginkgo bilob

10、a I.(EG) were studied, from which the ginkgolide-producing strains were screened orientationally, by means of studying endo-cellular metabolites from trial-strains. First of all, strains G3.I, G： ja, G3b, GAR, GAY, F1-3 and F3 were obtained from primitive strain EG3, in the course of screening. More

11、over, strains G3b, GAR, GAY, F1-3 and F3 were identified a sDeuteromycotina, Hyphomycetes, Tuberculariales, Tuberculariaceae, fusarium sp. Besides, the endo-cellular metabolites of the all strains were detected and screening, based on the analysis methods in which samples were compared with authenti

12、c Ginkgolides by HPLC and ESI-MS. Thus, it may be concluded that ginkgolide A, ginkgolide B and bilobalide occur in metabolites of strains F3 and 3b- Meanwhile, the substances against Gram-positive bacteria were discovered in culture broths of Fj.3.After further isolation and purification, compounds

13、 F沈阳药科大学硕士学位论文 ABBREVIATION 缩语表 AC AT: Acyl-CoA： cholesterol acyltransferase COSY: Correlated Spectroscopy DEPT: Distortionless Enhancement byPolarization Transfer DMSO: Dimethy Sulfoxide ELSD: Evaporative Light-Scatter Detector ESI-MS: Electro Spray Ionization - Mass Spectrum BB: Bilobalide GA: Gin

14、kgolide A GB: Ginkgolide B GC: Ginkgolide C BB: sampleor peak of which retention time was similar to that of Bilobalide G A、： sampleor peak of which retention time was similar to that of Ginkgolide A GB: sampleor peak of which retention time was similar to that of Ginkgolide B GC: sampleor peak of w

15、hich retention time was similar to that of Ginkgolide C HIV: Human Immunodeficiency Virus HMBC: Heteronuclear Multiple-Bond Correlation HMQC: Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence HPLC: High Performance Liquid Chromatography IR: Infrared absorption spectrum NMR: Nuclear Magnetic Resonance PAF: Pl

16、atelet Activating Factor PDA: Potato Dextrose Agar RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA RPLPs: Restriction Fragment Length Polymorphisms RID: Refractive Index Detector TLC: Thin Layer Chromatography UV: Ultraviolet absorption spectrum 沈阳药科大学硕士学位论文 _ nm 第 一 章 前 言 1. 内 生 真 菌 的 研 究 概 况 111 1.1内 生 菌

17、 的 定 乂 1866年， De.Bary首先提出内生菌 （ Endophyte) 是生活 在植 物 组 织 内 部 的 微 生 物 ，用 以 区 别 那 些 生 活 在 植 物 表 面 的 表生菌 。 按 此 定 义 植 物 的 致 病 菌 和 菌 根 菌 也 属 于 内 生 菌 的 概 念范畴。 1986年， Carroll将 内 生 菌 的 定 义 进 一 步 扩 展 为 生 活 在 地上 部 分 、 活 的 植 物 组 织 内 并 不 引 起 病 害 症 状 的 真 菌 。在 这 个概念 范 畴 内 不 包 含 植 物 的 致 病 菌 和 菌 根 菌 。 1991年 ， Petr in

18、i将 内 生 菌 定 义 为 那 些 在 其 生 活 史 中 的 某一 阶 段 生 活 在 植 物 组 织 内 ，对 植 物 组 织 没 有 引 起 明 显 病 害 症状的 菌 。这 个 定 义 包 括 那 些 在 其 生 活 史 中 的 某 一 阶 段 表 生 的腐生菌 ， 对 宿 主 暂 时 没 有 伤 害 的 潜 伏 性 病 原 菌 和 菌 根 菌 。 目 前 关 于 内 生 菌 的 概 念 范 畴 还 有 争 议 ， 但 Petrini的内 生菌 概 念 被 广 泛 接 受 。 在 以 往 的 研 究 中 ， 内 生 菌 都 是 内 生 真 菌，最 近 出 现 了 几 篇 植 物 内

19、生 细 菌 的 报 道 ，所 以 内 生 菌 包 含 内生细菌 和 内 生 真 菌 。 1.2内 生 真 菌 的 生 物 学 意 义 内 生 真 菌 长 期 生 活 在 植 物 体 内 的 特 殊 环 境 中 ，并 与 宿 主 协同 进 化 ， 在 演 化 过 程 中 二 者 形 成 了 互 惠 共 生 的 关 系 ，一 方 面内生 真 菌 可 以 从 宿 主 中 吸 收 营 养 供 自 己 生 长 ，另 一 方 面 内 生真菌在 宿 主 的 生 长 发 育 和 系 统 演 化 过 程 中 起 重 要 作 用 。它 的 生 物 学作 用 主 要 包 括 ： 内 生 真 菌 在 低 氮 水 平

20、的 土 壤 中 ， 可 增 加 宿 主 对 氮 元 素 的 吸 收 ； 还 能 增 强 宿 主 抗 旱 的 能 力 。 沈阳药科大学硕士学位论文 前言 _ 内 生 真 菌 产 生 植 物 生 长 激 素 ， 如 赤 霉 素 ， 可 促 进 宿 主 的生长。 内 生 真 菌 在 宿 主 内 和 纯 培 养 中 产 生 有 毒 物 质 ， 如 麦 角 生 物 碱 等 ， 这 些 内 生 真 菌 的 次 级 代 谢 产 物 可 对 植 物 致 病 菌 和 有 害 昆 虫 有 抗 性 。 内 生 真 菌 可 产 生 一 些 重 要 的 治 疗 人 类 疾 病 的 药 物 。 从 目 前 己 经 研 究

21、 过 的 植 物 来 看 ， 可 以 推 断 内 生 真 菌 在 植 物 体 内 是 普 遍 存 在 的 。 通 过 对 内 生 真 菌 和 宿 主 专 一 性 分 析 ， 平 均 每 种 宿 主 有 4-5 种 专 性 内 生 真 菌 ， 按 地 球 上 有 25万种植 物 计 算 ， 内 生 真 菌 总 数 可 能 超 过 100 万 种 。 可 见 自 然 界 中 存 在 着 大 量 的 内 生 真 菌 资 源 急 待 我 们 去 开 发 。 1.3内 生 真 菌 的 研 究 方 向 自 1898年 Vogl从 黑 麦 草 种 子 内 分 离 出 来 第 一 株 内 生 真 菌至 今 ，

22、关 于 内 生 真 菌 的 研 究 已 有 一 百 多 年 的 历 史 ，但 从 1890 年到 1980年 ， 很 少 有 人 进 入 到 这 一 领 域 的 研 究 。 直 到 八 十 年 代初 期 ， 内 生 真 菌 的 研 究 才 被 重 视 ， 大 多 数 研 究 工 作 集 中 在 温带 地 区 和 亚 热 带 地 区 具 有 重 要 经 济 价 值 的 植 物 。 从 整 体 来 看 ，内 生 真 菌 的 研 究 范 围 是 相 当 宽 泛 的 。但 基 本上 可 以 归 纳 为 以 下 两 方 面 的 研 究 。 基 础 理 论 方 面 的 研 究 ： 内 生 真 菌 入 侵

23、宿 主 的 分 子 机 理 ； 内 生 真 菌 与 宿 主 的 关 系 ； 内 生 真 菌 在 植 物 体 内 生 命 活 动 的 分 子 调 控 ； 内 生 真 菌 的 检 测 和 鉴 定 ； 在 广 泛 的 地 理 范 围 内 对 更 多 的 植 物 进 行 内 生 真 菌 多 样 性 的 研究 ; 沈阳药科大学硕士学位论文 _ n _ 内 生 真 菌 对 宿 主 和 组 织 专 一 性 机 理 ，分 布 等 生 态 学 问 题 。 实 际 应 用 方 面 的 研 究 ： 内 生 真 菌 在 植 物 活 力 和 环 境 污 染 检 测 方 面 的 应 用 ； 内 生 真 菌 作 为 植 物

24、 病 害 的 生 物 防 治 ； 内 生 真 菌 产 生 的 重 要 生 物 活 性 物 质 和 酶 的 筛 选 。 关 于 内 生 真 菌 产 生 的 重 要 生 物 活 性 物 质 和 酶 的 筛 选 是 目 前 内 生 真 菌 研 究 领 域 的 一 个 热 点 ，是 微 生 物 学 家 、植 物 学 家 、 化学 家 ，尤 其 是 药 学 工 作 者 所 关 注 的 对 象 。 因 为 通 过 对 内 生 真 菌次 级 代 谢 产 物 的 研 究 ，可 以 筛 选 得 到 一 些 结 构 新 颖 、活 性 专一的 物 质 。 这 些 物 质 或 能 直 接 成 为 预 防 和 治 疗

25、某 些 疾 病 的 药 物 ，或 能 作 为 先 导 化 合 物 ， 为 新 药 设 计 提 供 思 路 和 模 型 。 1991年美 国 蒙 大 拿 州 立 大 学 植 物 病 理 系 化 学 家 Andre St ierle博士从 短 叶 红 豆 杉 的 韧 皮 处 分 离 到 一 株 能 产 紫 杉 醇 的 真 菌 化 JdJ/zz/ces 。 紫 杉 醇 产 生 菌 发 现 的 现 实 意 义 在 于 通 过 微 生 物 途 径 生 产 紫 杉 醇 ，可 减 少 人 类 对 紫 杉 资 源 的 破坏 ， 同 时 为 今 后 大 量 生 产 紫 杉 醇 ， 满 足 癌 症 患 者 的 需

26、 要 、 造福人 类 开 辟 了 一 条 新 途 径 。 关 于 紫 杉 醇 产 生 菌 是 由 于 共 进 化 作 用 还 是 由 于 基 因 转 移 作 用 获 得 产 紫 杉 醇 的 代 谢 机 制 ， 到 目 前 为 止 还 是 一 个 迷 。 所 以 内 生 真 菌 次 级 代 谢 产 物 的 研 究 ， 对 于 阐 明 生 物 进 化 机 制 ， 加 深对 生 物 体 之 间 竞 争 与 生 存 关 系 的 了 解 以 及 丰 富 真 菌 多 样 性 均具有重要意义 2。 1. 4 内 生 真 菌 次 级 代 谢 产 物 研 究 的 基 本 步 骤 LrrulRU训 沈阳药科大学硕

27、士学位论文 前言 2. 银杏树组织的化学成分 银杏树 （ Ginkgo biloba L.)又 名 公 孙 树 ，是 古 老 树 种 之 一，为 一 科 一 属 一 种 的 特 殊 植 物 。 银 杏 树 能 经 历 两 百 多 万 年 的 地质变 迁 和 沧 海 桑 田 ，仍 能 孑 遗 下 来 ，必 然 有 它 独 特 的 地 方 。 于 是 ，至 上 世 纪 六 十 年 代 以 来 国 内 外 植 化 学 家 对 银 杏 树 组 织 的 化 学 成分 和 药 理 作 用 做 了 大 量 的 研 究 工 作 。 目 前 已 明 确 结 构 的 成 分 大约有 70种 左 右 。表 1-1

28、列 出 了 银 杏 树 中 部 分 有 生 物 活 性 的物质。 目 前 ，银 杏 树 组 织 中 的 活 性 成 分 主 要 来 源 于 银 杏 叶 提 取 物 。 治 疗 心 脑 血 管 疾 病 的 药 品 ，应 用 于 老 年 病 的 临 床 治 疗 ，并 申 请 了专 利 ， 商 品 名 ： Egb761 。 此 后 ， 按 德 国 Schwabe专 利 工 艺 生 产的 Egb761成 为 国 际 上 标 准 的 银 杏 叶 提 取 物 ，其 质 量 标 准 ： 黄 酮含量 24%， 萜 内 酯 含 量 6% ， 成 为 国 际 上 银 杏 叶 制 剂 的 通 用 标准 11。 8

29、沈阳药科大学硕士学位论文 _ 前言 .doc 表 1-1银杏中有生物活性的主要成分 种 类 名 称 分子式 组织 来源 生物活性 参考 文献 山奈酚 Cl5HlO 6 山奈酚 -3-0-葡萄糖甙 C21H20011 黄 山奈酚 -3-0-芸 香糖甙 C27H30015 酮 山奈酚 -7-0-葡萄糖甙 C21H20011 兀 山奈酚 -3-葡萄糖 -2, 6- 二鼠李糖甙 C33H40019 扩张冠状血管， 抑制血管紧张 素转换酶 (ACEZ )的活 性。 槲皮素 Cl5HiO 7 银杏叶 3, 4 及 黄 酮 甙 槲皮素 -3-0-葡萄糖甙 C21H20012 槲皮素 -3-0-鼠李糖式 C2

30、1H200H 槲皮素 -3-0-芸香糖甙 C27H30016 槲皮素 _3_葡萄糖 -2， 6- 二鼠李糖甙 C33H40020 异鼠李素 Cl6Hl2 7 异鼠李素 -3-0-葡萄糖甙 C22H22 12 异鼠李素 _3-0-芸 香糖甙 C28H32 16 双 银杏双黄酮 Ci2H22 10 银杏 叶， 异银杏双黄酮 C32H22 10 细胞毒作用 黄 去甲基银杏双黄酮 C3lH20 10 5， 6， 7 穗花杉双黄酮 C3 Hl8 10 银杏 介导抑制 N0 酮 金钱松双黄酮 C； i3H24 10 外种皮 合成作用 5-甲氧基去甲银杏双黄酮 C32H22 JJ 沈阳药科大学硕士学位论文

31、前言 种 类 名 称 分子式 组织 来源 生物活性 参考 文献 银 杏 萜 内 酯 白果内酯 Cl5Hl8 8 银杏 叶， 根皮 组织 对中枢神经的 作用， 抗血小板活化 因子 （ PAF)的 作用 8 银杏内酯 A C2 H24 9 银杏内酯 B C2 H24 l 银杏内酯 C C2 H24 lL 银杏内酯 J C2 H24 10 银杏内酯 M C2 H24 10 仅存于 根皮中 有 机 酸 6-羟基犬尿喹啉酸 Cl H7 4N 银杏叶 N- 甲基 - D- 天 冬 氨 酸 受 体 拮 抗剂 9 焼 基 酚 酸 4_甲氧基吡哆酸 C9Hl3 3N 银杏 果实 细胞毒素 3 白果酚 C2lH3

32、4 银杏 果实 抗肿瘤作用 10 白果二酚 C2lH34 2 银杏 果实 白果酸 CUH:M 3 银杏 果实 抗肿瘤作用， 抑菌作用 氢化白果酸 C22H36O3 银杏 果实 抗炎、抗过敏 作用，抑菌作 用 5 氢化白果亚酸 CiJlH34 银杏 果实 沈阳药科大学硕士学位论文 _ _ 3. 银杏内酯的结构与生物活性相关性的研究 银杏树中存在着一类结构特殊、活性专一的化合物 - 银杏萜内 酯，简称为银杏内酯。有关银杏内酯的研究最早见于 1932年 12， 1 9 67 年， M.Mamyama等对银杏内酯作了更深入的研究，阐明了银杏内酯系列 化合物的结构 13 14。国内对银杏内酯的研究起步较

33、晚， 1988年，游松等 首次从银杏叶中分离得到银杏内酯 B和银杏内酯 C15，直到九十年代， 有关银杏内酯的研究才逐渐见诸报道。目前所分离到的银杏萜内酯类化合 物有五种：结构式和分子式见： Fig. 1-1。 GINOKLIDE Ri (C3) R2 (C,) R3(C7) MW FM A OH H H 408 C20H24O9 B OH OH H 424 C2 H24 1 C OH OH OH 440 C2 H24 11 J OH H OH 424 C2 H24 1 M H OH OH 424 C20H24O10 BILOBALIDE 326 CisHi8 8 图 1-1.银杏内酯和白果内

34、酯的结构式 Fig.1-1. Structures of GINKGOLIDES and BILOBALIDE 银杏内酯为二萜类化合物，它们都含有一个叔丁基、三个内酯 环 、 二 个 戊 烷 环 和 一 个 四 氢 呋 喃 环 。 另 外 ， 银 杏 叶 中 还 存在一种与 二 萜 内 酯 结 构 相 关 的 倍 半 萜 化 合 物 白 果 内 酯 ， 它由 十 五 个 碳 组 成 ，含 有 一 个 叔 丁 基 、三 个 内 酯 环 、一 个 戊 烷 环 。所 有 银 杏 内 酯 都 是 苦 的 ， 对 无 机 酸 极 度 稳 定 。 银 杏 内 酯 和 白 果内 酯 主 要 存 在 于 银

35、杏 叶 和 根 皮 中 ， 但 含 量 极 低 ， 仅 为 万 分 之 几甚 至 百 万 分 之 几 。 茎 皮 以 沈阳药科大学硕士学位论文 _ im _ 及 根 皮 内 部 组 织 中 含 量 更 低 。 目 前 标 准 EGB761 (银杏叶提取物 ） 中萜内酯的总量仅大于 6%。由于银杏内酯和白果内酯结构复杂，化 学 合 成 困 难 较 大 ， 直 到 1988年 才 以 20多 步 复 杂 而 微 妙 的 合 成路线 第一次完成 了银杏内酯 B和银 杏内酯 A的全合成 1 6 17。合成工艺 复杂， 成 本相当高，目前 仅限于实验室研 究。进入九十年代，植物 组织 培 养和毛状根培养

36、 被引入银杏内酯 的研究，虽然取得了一些成 果 18 19,但由于受植 物组织培养本身 技术环节的限制，尚不具备实 用价值。所以市 售银杏内酯类药 物多以复方制剂形式来源于银杏 叶 提取物。 二 十 世 纪 八 十 年 代 ， Pierre G. Braguat发 现 银 杏 内 酯 是 具有高度 专属性 的 血小板活化因子 （ PAF)受体拮抗剂，其中银杏内酯 B的 活性最强 2 0 。当 PAF 为 5X10_8 mol/L 时，内酯 B 的 IC50=0.82X 10_7 mol/L。 这 类 化 合 物 对 花 生 四 烯 酸 代 谢 没 有 明 显影响，也不与神 经递质结合。 血小板

37、激活剂 PAF是一种含手性炭 的甘油衍生物，已 被鉴定为 1-烷基 -2- (R)-乙酰基 -甘油 -3-磷 酰 胆 碱 ， 是 目 前 己 知 的 作 用最强的 低分子量 血小板激活剂。 PAF的结构式见 Fig. 1-2。除血小板和中性 白 细 胞对其敏感外， 其他如单核细胞 、巨噬细胞、平滑肌细胞以及 内 皮细胞等也敏感 。 图 1-2.血小板活化因子的结构式 Fig. 1-2. Structure of Platelet Activating Factor PAF受体在体内极其稀少，故人们对其结构的研究和受体的纯化 12 沈阳药科大学硕士学位论文 _ PW _ 工作一直进展不大。 19

38、91年， Richard等 克 隆 出 人 体 受 体 的 cDNA， 可表达人的 PAF受 体 。根 据 所 克 隆 出 的 人 PAF受体与视紫素类 G 蛋白连接的受体在跨膜区有广泛的序列同源性，表明 PAF受 体 属 于 视紫素类受体家族。 PAF生 物 活 性 广 泛 ， 可 以 引 起 血 栓 、 哮 喘 、 过 敏反应、内毒素休克、溃疡性结肠炎、牛皮癣和肾小球肾炎等病变。 近 期 研 究 发 现PAF也 是 一 种 强 效 内 分 泌 调 节 剂 ， 可 能 在 某 些 人 类 疾 病的发生和发展中起重要作用 21。在植物王国中银杏内酯的笼状结 构 是 非 常 特 殊的 ， 这 使

39、 它 可 以 与 PAF共同竞争受体上的结合位点， 特 别 是 银 杏 内酯 B， 由 于 分 子 中 醚 氧 与 羰 基 氧 间 的 距 离 和 PAF中的 相一致，活性最强 22。所以以银杏内酯 B为 代 表 的 PAF受 体 结 抗 剂 受到当今药学界的广泛注目。 4. 银 杏 内 酯 新 生 源 探 究 的 可 行 性 目前，银杏内酯的来源大致有三个途径： 、从银杏叶中提制。 这是 目 前 最 经 济 有 效 的 方 法 ，但 仍 受 到 资 源 、地 域 、季 节 、气 候 的 限制。 、用 化 学 方 法 合 成 。但 合 成 工 艺 复 杂 ，代 价 昂 贵 ，抗 PAF-ace

40、ther活性较低。 、植物组织培养和毛状根培养产生银杏内 酯。这 是 一 个 颇 有 发 展 前 途 的 途 径 ， 可 能 是 未 来 生 产 天 然 活 性 物 质 的 有 效 途 径 ，但 由 于 植 物 组 织 培 养 和 细 胞 工 程 本 身 就 属 于 一 项 发展 中 的 技 术 ， 目 前 还 很 难 实 现 工 业 化 生 产 。 因 此 ， 寻 求 银 杏 内酯的新 生源具有重要意义。 我们将研究的方向定位于银杏树内生真菌次级代谢产物的筛选 是经过细致论证的。论点和论据如下所述： 、微 生 物 发 酵 技 术 是 一 项 历 史 悠 久 、理 论 完 善 、技 术 成 熟

41、 、 与工业生产紧密结合的技术 23。人类对微生物的认识和研究已 经有三百多年的历史，关于微生物纯培养技术的建立也有近两百 年的历史，近代发酵工业的发展史也可以追溯到十九世纪初。在 13 沈阳药科大学硕士学位论文 _ _ 这期间积累和总结的经验不仅使微生物发酵技术更加成熟，也为 动植物细胞培养和酶工程提供了宝贵经验。近期发展起来的基因 工程技术和自动化控制技术，推动了发酵工业向着崭新的方向发 展。利用基因工程技术和细胞融合技术构建的新菌株，经过新型 发酵为人类提供了许多活性物质，大大降低了成本；发酵控制采 用了电子计算机，生产流程实现了连续化、自动化。在现代科学 和工程飞速发展的今天，微生物发

42、酵技术越来越成为一项多学科 交叉的技术，也必将在未来的生物工程和医药技术产业化的进程 中继续发挥重要作用。 、内 生 真 菌 长 期 生 活 在 植 物 体 内 的 特 殊 环 境 中 ，并 与 宿 主协 同进化，在演化过程中二者形成 了互惠共生的关系。有的科学家 认为这种共生关系 （ Symbiotic Relation) 是 牢 固 的 、可 遗 传 的 。 他们认为生命是在海洋里进化的，但是只有在共生关系建立后， 才使生命在干燥的、条件恶劣的陆地上生存下来成为可能。目前， 陆地上的植物在封闭水分、运输水分以及控制水分蒸发总量方面 的适应能力非同寻常，但在 4亿年前，脱离海洋和淡水向陆地扩

43、 张的过程，还是以植物与真菌的共生关系为基础的。真菌在陆地 居民中是卓而不群的，它们不进行光合作用，靠吸收作用获取食 物；它们缺乏伪足，所以不能游走，但它们却能耐受暂时的干 旱。 旱季，它们会安静地等待，湿气再现时它们就掌权了。当真菌同 植物的根部在一起，它们能把水从地下源源不断地抽上来，从而 克服了陆地的干旱，植物得以旺盛的繁殖。 加拿大植物学家 K.A.皮罗金斯基和 D.W. 马 洛 赫 为 了 解 释 4.5亿年前植物的起源，提出了 “ 真菌融合 ” 假说。他们设想真 菌和藻类共同进化，并最终结合发育成植物。彼德 阿斯塔特进 一步扩展了皮罗金斯基 -马洛赫假说，认为植物在与真菌长期共 沈阳药科大学硕士学位论文 _ tm _ 处的过程中，窃取并保留了真菌的基因 24。在此假说的基础上 推测：内生真菌就起源于那些没有与藻类融合，而又没有被淘汰 的真菌；真菌在与植物长期共处的过程中，盗取或借用了植物的 基 因 。事 实上 一 些 分 子 生 物 学 的 实 验 结 果 也 支 持 上 述 观 点 。 Leuchtmann和 Clay通 过 对 分 离 自 不 同 寄 主 的 内 生 真 菌 同 工 酶 分