分子遗传学复制.ppt

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1、关于分子遗传学复制现在学习的是第1页，共39页现在学习的是第2页，共39页 滚环复制的电镜照片现在学习的是第3页，共39页 哪些DNA进行滚环复制?真核rDNA的扩增,F因子DNA的转移,裂解途经的复制, X174,M13.G4等单链环状DNA噬 菌体 第二阶段复制都是进 行滚环复制的.现在学习的是第4页，共39页 3 5TraY/ I 多体在环上移动，DNA 解链 单链进入受体 3 5 合成互补链 3 5 供体的缺口被封闭 受体中的 DNA 成环图 1238 F 因子 DNA 的转移(仿 B.Lewin:GENES,1997，Fig14.22)现在学习的是第5页，共39页 184 bp 23

2、bp 52bp 23bp 61bp 5 基因 1 1.1A 1.1B A-T 丰富区 基因 1.1 3 TTATGCTGAGTGATATC TTATGCTGAGTGATAT Rnase 酶切位点 图 11-40 T7 噬菌体复制起始区的结构现在学习的是第6页，共39页表 11-8 T7 DNA合成所需的酶和蛋白酶基因结构和功能RNA pol198.1KDa 单链，可能合成引物DNA pol584KDa，ssDNA35外切活性，有的聚合酶活性，组成 DNA po 亚基trxA宿主基因合成 12KDa，硫氧还蛋白(thioredoxin)，pol 亚基解旋酶458KDa 的产物三磷酸酯酶458KD

3、a 的产物引发酶466KDa 的产物，识别 5GGGTC3或 5TGGTC3SSB2.5单链结合蛋白内切酶3降解宿主 DNA 用于合成5外切酶6同上连接酶1.3封闭缺口现在学习的是第7页，共39页二.DNA末端起始复制n线性双链DNA的复制有的是从一端开始的: 腺病毒（Adenovirus） 29 DNAs 脊髓灰质病毒（poliovirus)n腺病毒DNA全长35937 bp,线性双链，n两端各有反向重复顺序103162 bp，两末端各有50 bp为复制起点。n其复制是以单链置换（strand displacement）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。现在学习的是第8页，共39页 线

4、状 DNA 5 3 3 5 在左侧 5 合成起始 5 3 3 5 复制叉的 5 移动 3 3 5 复制达到末端 5 3 时一条单链被 + 置换出 5 3 3 5 末端反向重复 顺序配对，形 5 成双链 3 以单链为模板 5 3 的合成 3 5 图 11-41 线病毒 DNA 复制的单链取代模型(仿 B.Lewin:GENES,1997，Fig14.13)现在学习的是第9页，共39页 末端蛋白 DNA 聚合酶 dCDP -COH -COH -C 3 5 pppA -Ser-C-OH 3 -OH-GpTpApGpT 图 11-43 线病毒末端蛋白结合在 DNA 的 5端并提供 一个 C-OH，作为

5、新合成 DNA 的引物。 (仿 B.Lewin:GENES,1997，Fig14.15) 丝氨酸 O H N H C 多肽链 C 多肽链 CH2 蛋白DNA 连接 O OP = O C CH2 O O OH 3 腺病毒 DNA 图 1142 线病毒 DNA 和 55KD 蛋白的丝氨酸连接 (仿 B.Lewin:GENES,1997，Fig14.14) 现在学习的是第10页，共39页三.复制的终止n1.E.coli的复制终止n现已发现有两个终止区域（terE,D,A和ter C,B），位于相遇点的另一侧100Kb处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。nter顺序有一个23bp的区域

6、，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性。n终止需要tus(terminus utilization substance)基因的产物Tus(36kD)， Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进。nter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来实行终止现在学习的是第11页，共39页现在学习的是第12页，共39页现在学习的是第13页，共39页第六节 复制的过程n一.半不连续复制现在学习的是第14页，共39页nE.colidUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。n尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosyla

7、se），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。 尿嘧啶 DNAG A C T T N-糖基 G A C T T AP G A C T T Pol G A C T TC U G A A 化酶 C G A A 内切酶 C G A A GA C T G A A AP AP 图 11-48 在 DNA 合成中 U 的切除和修复现在学习的是第15页，共39页以下实验证实了这个解释：n(1)在dut -突变体（dUTPase缺失）中冈崎片段比在dut +中为短。这是因为U掺入机

8、会增加；n(2)在ung- （尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突变体中，新合成的DNA约有一半由片段组成。n(3)因为尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不会切除U的糖苷链，也就不会出现AP位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保持了半不连续的原貌。n在dut-, ung-双突变体中，结果和实验（2）相同，更进一步证实了此推测。现在学习的是第16页，共39页3 后滞链 5 引发酶合成引物5 3 5 3RNA 引物 RNA 引物3 后滞链 5 DNA pol 在引 5 3 物 3OH 延伸， 冈崎片断 形成冈崎片断3 后滞链 5 5 3 DNA pol切除引 物，填补缺口 3 后滞链 5 5 3 连接酶封闭缺口 连接酶 图

9、11-53 后滞链的合成 现在学习的是第17页，共39页现在学习的是第18页，共39页左向前导链 右向前导链5210 5211 前期区 A-T 10bp 27bp 丰富区 184 5192 5208 5229 5243/0 13 29 37 61 64bp 最低限度 ori 具有 4050活性 82bp 完整 ori 区具有 100活性 CAGAGGCCGAGGCG GGCCTCGGCCTCTG CATAAATAAAAAAAATTA GTCTCCGGCTCCGC CCGGAGCCGGAGAC GTATTTATTTTTTTTAAT 5229 13 29 图 11-61 SV40 复制起始区的结构

10、现在学习的是第19页，共39页 1 1 1 13 35 5 2 24 49 9 3 37 71 1 6 62 25 5 6 67 76 6 7 70 08 8a aa a 与 DNA ATPase，解链酶 宿主专一 结合区 活性区，和 DNA 位点 聚合酶结合 图 11-62 T 抗原的结构现在学习的是第20页，共39页现在学习的是第21页，共39页现在学习的是第22页，共39页现在学习的是第23页，共39页现在学习的是第24页，共39页酵母的自主复制区nARS(autonomously replicationg sequence)n发挥复制起点的功能，但是过量的。n酵母染色体的着丝粒附近为A

11、RS1序列nARS1分为A,B,C三个功能区, A,B起主要作用,C起次要作用。nA区为15bp,其中11个保守，称ACS (ARS consensus sequence)。有复制起始子的功能nB区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区。nB3是ABF1（ARS-binding factor 1）结合区，现在学习的是第25页，共39页酵母的复制现在学习的是第26页，共39页nORC：由6个亚基组成相当于Dna A和 的O蛋白，与 A/B1结合，结合于游离的DNA nCdc6:相当于DnaC,及的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体上。此对在Origin上起始复制是必须的。 nMcm: DnaB

12、 螺旋酶。即 licensing factornABF1（转录因子）结合于B3现在学习的是第27页，共39页现在学习的是第28页，共39页 原核和真核生物复制体系的比较nE.coli SV40/人 酵母 功能n DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白n DnaB DnaB T抗原 MCM 解旋酶n DnaC P ? Cdc6 装配因子n DnaG DnaG Pol-引发酶 Pol-引发酶 引发酶 n Pol的 亚基 Pol Pol,Pol 聚合酶n Pol的亚基 Pol Pol,Pol 校正n Pol的亚基 PCNA PCNA 滑动钳n 复合体 RF-C RF-C 滑动钳装配器n SSB RF

13、-A RF-A 单链结合蛋白现在学习的是第29页，共39页 八聚体在 DNA 上装配 先结合成八聚体 H4 H3 H4 H3 H3H4 四聚体 H2B H2A H4 H3 H4 H3 H4 H3 H4 H3 H4 H3 H2B H2A H2B H2A H4 H3 H4 H3 图 11-59 在体外 DNA 既可以直接和完整的组蛋白八聚体相互 作用可先和 H3-H4 两个四聚体装配，然后再和 H2AH2B 装配 (仿 B.Lewin:GENES,1997，Fig27.26)现在学习的是第30页，共39页 若八聚体拆开并重新装配，预期新组成的 预期新组成的八聚体所含的组蛋白 八聚体将含有新的和老的

14、两种组蛋白，其 或全部是新的，或全部是老的 组成或是有规律的，或是随机的 交联组蛋白，提取八聚体，密度分析 重 轻 重 轻 老八聚体 新八聚体 重新装配的八聚体 图 11-60 组蛋白的同位素标记实验，表明组蛋白八聚体的复制不是全保留的。 ( 仿 B.Lewin:GENES,1997，Fig27.27)现在学习的是第31页，共39页 Pvu Bg1 Bam H1 Bam pBR322 TEL TEL 四膜虫rDNA ARS Pvu Bg1 Bam H 连接 Pvu 转化酵母 Pvu 传几代酵母DNA Pvu Pvu 连接 转化酵母 传几代 图 11-56 四膜虫与酵母TEL的拼接以及酵母细胞将

15、其特有的TEL加到四膜虫 的TEL上(参考Shampg,J and Blackburn et al: Nature1984,310:154-157) n 现在学习的是第32页，共39页 结合 5 3dGTP TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG DNA 模板和 DNA AACCCCAACCCC AACCCCAAC 引物配对3 5 3 5 聚合5 3 dGTP 以 RNA 为模板在 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGG DNA 引物3端 AACCCCAACCCC AACCCCAAC 直接加核苷酸 3 5 3 5 延伸 5 3 延着 RNA 模板 TTGGGGTTGGGGTTGGGG

16、TTGGGGTTG DNA3延伸 AACCCCAACCCC AACCCCAAC3 5 3 5 移位 酶向引物的新 3端移动5 3 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG AACCCCAACCCC AACCCCAAC 3 5 3 5 图 11-67 端粒酶复制机制模型(仿 Greider and Blackburn:Nature1989, 337:331-337) 现在学习的是第33页，共39页 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 AACCCC GGGGTTGGGG图 11-68 端粒3延伸，末端回折形成发夹结构现在学习的是第34页，共39页现在学习的是第35页，共39页现在学习的是第36页，共39页 RNase H RNA (RNA 引物) Ori 600 400 200 0 200 400 600 RNA Rop 图 11-69 Col E1 质粒的复制调控 现在学习的是第37页，共39页现在学习的是第38页，共39页感谢大家观看感谢大家观看9/1/2022现在学习的是第39页，共39页