蛋白质与酶工程复习资料.pdf

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1、酶工程复习提纲酶工程复习提纲第一章第一章 绪论绪论1.1. 酶及酶工程的概念。酶及酶工程的概念。酶：是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质。酶工程：利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需产品的一门工程技术。(名词解释 )2.2. 了解酶学的发展历史，尤其是一些关键事件。了解酶学的发展历史，尤其是一些关键事件。1833 年，Payen 和 Persoz 发现了淀粉酶。1878 年，Kuhne 首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。给酶一个统一的名词，叫 Enzyme，这个词来自希腊文，其意思“在酵母中” 。1902 年，Henri 提出中间产物学说。19

2、13 年，Michaelis and Menton 推导出酶催化反应的基本动力学方程，米氏方程： V=VmS/ （Km+S） 。1926 年， Summer 分离纯化得到脲酶结晶。 人们开始接受 “酶是具有生物催化功能的蛋白质” 。Cech and Altman 于 1982 和 1983 年发现具有催化活性的RNA 即核酸类酶， 1989 年获诺贝尔化学奖。 现已鉴定出 5000多种酶，上千种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。3.3. 了解酶在医药、食品、轻工业方面的应用。了解酶在医药、食品、轻工业方面的应用。医药： （1）用酶进行疾病的诊断：通过酶活力变化进行疾病诊断，谷丙转氨酶/谷草

3、转氨酶用于诊断肝病、心肌梗塞等，酶活力升高；葡萄糖氧化酶用于测定血糖含量，诊断糖尿病。（2）用酶进行疾病的治疗：来源于蛋清、细菌的溶菌酶用于治疗各种细菌性和病毒性疾病；来源于动物、蛇、细菌、酵母等的凝血酶用于治疗各种出血病；来源于蚯蚓、尿液、微生物的纤溶酶用于溶血栓。（3）用酶制造各种药物：来源于微生物的青霉素酰化酶用于制造半合成青霉素和头孢菌素；来源于动物、植物、微生物的蛋白酶用于生产L-氨基酸。食品：生产低聚果糖，原料为蔗糖，所需酶为果糖基转移酶、蔗糖酶（黑曲霉、担子菌） ；生产低聚异麦芽糖，原料为淀粉，所需酶为-淀粉酶、-淀粉酶、真菌-淀粉酶（米曲霉） 、-葡萄糖苷酶（黑曲霉） 、普鲁兰

4、酶、糖化型-淀粉酶（枯草杆菌） 。轻工业：用酶进行原料处理；用酶生产各种轻工、化工产品；用酶增强产品的使用效果。第二章第二章 酶学基础酶学基础1.1. 酶的化学本质？酶与其他无机或者有机催化剂相比较，具有哪些催化特性？酶的化学本质？酶与其他无机或者有机催化剂相比较，具有哪些催化特性？化学本质：生物催化剂。催化特性： （1）高效率：比非催化高1081020 倍；比非酶催化高1071013 倍，酶催化反应的效率之所以高， 是由于酶催化反应可以使反应所需要的活化能显著降低。（2）高度专一性： 相对专一性、绝对专一性。相对专一性：键专一性：作用于具有相同化学键的一类底物；基团专一性：酶的作用底物含有某

5、一相同的基因。绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一种反应。（3）反应条件温和：一般在常温、常压、 pH 值近乎中性的条件下进行。 （4）酶催化是可调控的。2.2.解释酶作用专一性机制的学说有解释酶作用专一性机制的学说有哪些？其核心内容？哪些？其核心内容？（填空）（填空）锁钥假说：整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。诱导契合假说：酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补性状。当底物与酶接近时，底物分子可以诱导酶活性中心构象发生改变，使之成为能与底物分子密切结合的构象。3.3. 解释酶作用高效性的机制

6、有哪些？解释酶作用高效性的机制有哪些？（1）邻近效应与定向作用（2）电子张力作用：应变效应，底物分子的敏感键产生张力或变形（ 3）多元催化作用。酸碱催化：指通过向反应物提供质子或从反应物夺取质子而稳定过渡态、加速反应的一类催化机制。共价催化：某些酶分子能作为亲核催化剂或亲电催化剂分别放出或汲取电子而与底物分子形成不稳定的共价中间络合物， 反应活化能降低而加速反应，称为共价催化。 （4）酶活性中心的低介电区：表面效应，微环境效应。4.4. 什么是酶的活性中心？活性中心的构成？什么是酶的活性中心？活性中心的构成？活性中心：是指酶分子中直接与底物结合并完成酶催化反应的结构区域，该部位化学基团集中，并

7、构成一定空间构象。活性中心的构成：结合中心：与底物结合的部位，决定酶的专一性；催化中心：促进底物发生化学反应的部分，决定酶所催化反应的性质。5.5. 酶的一级结构、二级结构、三级结构和四级结构的概念，酶的四级结构与催化功能的关系？酶的一级结构、二级结构、三级结构和四级结构的概念，酶的四级结构与催化功能的关系？酶的一级结构： 一级结构是指构成酶蛋白的氨基酸组成的一条长肽链或多肽链。 酶的一级结构是酶的基本化学结构，是催化功能的基础。酶的二级结构：二级结构是指肽链骨架相邻区段借助氢键等沿轴向方向建立的规则折叠片与螺旋。是所有的酶必须具备的空间结构，是维持酶活性部位所必需的构象。酶的三级结构：三级结

8、构指在二级结构基础上肽链进一步的折叠片与盘绕成二维空间结构，多肽链中原来相距较远的序列可以集中到一个区域内。酶的四级结构：在三级结构基础上，由几个到十数个亚基(或单体)组成的寡聚酶或生物大分子称为酶的四级结构。关系：1、具有四级结构的酶，其功能可分为两类：与催化作用有关,与代谢调节有关 ,酶蛋白的一级结构是酶具有催化功能的决定性部分，而高级结构为酶催化功能所必需部分6.6. 什么是同工酶，举例说明？什么是同工酶，举例说明？指能催化相同的化学反应，但酶蛋白本身的分子结构组成及理化性质不同的一组酶。如：乳酸脱氢酶 LDH，可装配成 H4、H3M、H2M2、HM3、M4 五种四聚体。7.7. 根据酶

9、催化反应类型和机制不同，酶的分类？填空题根据酶催化反应类型和机制不同，酶的分类？填空题（1） 、氧化还原酶类：催化氧化还原反应（2)、转移酶类：催化分子基团从一个分子转移到另一个分子的反应（3） 、水解酶类：催化加水分解的反应（4） 、裂合酶类：双键上去除或加入一个基团的反应（5） 、异构酶类：催化分子间重排的有关反应（6） 、连接酶类：催化将两个分子连接在一起，并由ATP提供能量的反应8.8. 酶活力及比活力？国际酶活力单位酶活力及比活力？国际酶活力单位 IUIU 如何定义的？如何定义的？酶活力：在一定条件下，酶所催化的某一化学反应的速度，可用时间单位内底物的减少量或产物的增加量来表示。比活

10、力：指在特定条件下，每毫克酶蛋白所具有的酶的活力单位数。国际酶活力单位IU：在最适的反应条件（温度 25）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位， 1IU=1mol/min第三章第三章 酶促反应动力学酶促反应动力学1.1. 酶促反应初速度的概念？酶促反应初速度的概念？在研究酶促反应动力学中，为准确的表示酶活力，一般都用初速度表示，即酶反应初始阶段，即底物转化量 5%时的反应速度，也就是进程曲线的直线部分。2.2. 中间产物学说和过渡态理论？中间产物学说和过渡态理论？中间产物学说：酶的中间产物学说是由 Brown（1902）和 Henri（1903）提出的。其学说主要认为

11、酶的高效催化效率是由于酶首先与底物结合，生成不稳定的中间产物（又称中心复合物central complex） 。然后分解为反应产物而释放出酶。在酶促反应中，酶首先和底物结合成不稳定的中间配合物（ES） ，然后再生成产物（P） ，并释放出酶。反应式为 S+E=ESE+P，这里 S 代表底物，E 代表酶，ES 为中间产物，P 为反应的产物过渡态理论：过渡态理论即活化络合物理论， （transition-state theory） 。过渡态：以量子力学对反应过程中的能量变化的研究为依据，认为从反应物到生成物之间形成了势能较高的活化络合物，活化络合物所处的状态叫过渡态。过渡态理论是 1935 年由.埃

12、文斯和 M.波拉尼提出的，研究有机反应中由反应物到产物的过程中过渡态的理论。3.3. 米氏方程的动力学描述形式，米氏方程的动力学描述形式， K Km m,V,Vmaxmax的动力学参数意义。的动力学参数意义。（3,43,4题合成一个大题）题合成一个大题）V=VmaxS/ （Km+S）意义： （1）当 v=Vmax/2 时，Km=S。因此，Km 等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度，它的单位是摩尔/升。（2）Km 可以反应酶与底物亲和力的大小。Km 越小，酶与底物亲和力越大。（3）可用于判断反应级数：当S时，反应为一级反应；当S100Km 时，v=Vmax，反应为零级反应；当S100Km 时

13、，为混合级反应。（4）Km 是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km 值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的 Km 值，来判断是否为不同的酶。（5）Km 可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，通过测定酶在不同底物存在时的Km 值，Km 值最小者，即为该酶的最适底物。（6）可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当 S=10Km 时，v=91%Vmax，认为此时为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。4.4. 如何测定如何测定K Km m,V,Vmaxmax? ?Lineweaver-BurkLineweaver-Burk双倒数作图法的动力学表述形式。双倒数作图法的

14、动力学表述形式。5.5. 酶激活剂的概念？激活剂的种类？酶激活剂的概念？激活剂的种类？酶的激活剂：凡能提高酶的活性，加速酶促反应进行的物质都称为激活剂或活化剂。种类（按分子大小分类） ： （1）无机离子：无机阳离子金属离子（如钠离子、钾离子、镁离子等） ；无机阴离子（如氯离子、溴离子等） ；氢离子。（2）中等大小的有机分子：某些还原剂，如半胱氨酸、巯基乙醇、抗坏血酸，作用机制是使酶中的二硫键还原成巯基，从而提高酶活性或与底物、酶或ES 复合；EDTA（乙二胺四乙酸） ，作用机制是金属螯合剂，解除重金属离子对酶的抑制作用。（3）具有蛋白质性质的大分子物质（如酶原激活） 。第四章第四章 酶反应器酶

15、反应器1.1. 酶反应器的定义？酶反应器的定义？用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。2.2. 按结构区分按结构区分，常见的酶反应器类型，常见的酶反应器类型、定义及其特点？、定义及其特点？（类型有哪些以及填充式反应器的定义）大（类型有哪些以及填充式反应器的定义）大题题搅 拌 罐 式反应器：填 充 床 式反应器：流 化 床 式反应器：定义又称为批量反应器、间歇式搅拌罐。由容器、搅拌器及保温装置组成，底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出，反应完成之后，酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应的一类反应器。将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定

16、的条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）将底物溶液以足够大的流速， 从反应器底部向上通过固定化酶柱床，使固定化酶颗粒始终处于流化状态，使反应液的混合程度介于全混型和平推流型之间。 即可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度， 同时亦可用于需要供气体或排放气体（即固、液、气三相反应）的酶反应器称为流化床式反应器密度大， 可以提高酶催化反应的速度。 在工业生产中普遍使用。混合均匀，传质和传热效果好，温度和 PH 值的调节控制比较容易， 不易堵塞， 对粘度较大反应液也可进行催化反应特点反应比较完全， 反应条件比较容易调节控制鼓 泡 式 反应器：膜反应器：是利用从反应器底部通

17、入的气体产生的大量气泡， 在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器。 也是一种无搅拌装置的反应器。是一种将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器，可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。结构简单， 操作容易， 剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高， 适合于有气体参与的反应。清洗比较困难喷 射 式 反应器通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应， 适用于某些耐高温酶的一类反应器称为喷射式反应器。通入高压喷射蒸汽， 实现酶与底物的混合， 进行高温短时催化反应适用于某些耐高温酶的反应3.3. 选择和使用酶反应器时，要考虑哪些因素？选择和使

18、用酶反应器时，要考虑哪些因素？（1）所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度） ，才能得到较大的产品转化率。（2）能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。（3）应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。（4）应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产能力下降。第五章第五章 酶的生产酶的生产1.1. 酶的生产方法有哪些，各自特点如何？酶的生产方法有哪些，各自特点如何？提取分离法：采用各种提取、分离纯化技术从动物、植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来，再进行分离纯化的过程。特点：优点是设备简单、操作方

19、便；缺点是易受影响、工艺路线复杂。生物合成：利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术过程。特点：优点是生产周期短、产率高、不受外界条件影响；缺点是设备及工艺要求高、生产过程需严格控制。化学合成：特点是原料单体纯度要求高、只可合成已知化学结构的酶。2.2. 什么是组成型酶和调节型酶？什么是组成型酶和调节型酶？组成型酶：生物细胞中合成的酶的量比较恒定，环境对这些酶的合成速率影响不大。如DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。调节型酶：生物细胞中合成的酶的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。如大肠杆菌半乳糖苷酶。3.3. 什么是酶的诱导？什么是酶的

20、阻遏？什么实验证明了这两种现象？什么是酶的诱导？什么是酶的阻遏？什么实验证明了这两种现象？酶的诱导：某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的诱导。 （名词解释）证明实验：分解利用乳糖的酶有：半乳糖苷酶、半乳糖苷透过酶、硫代半乳糖苷转乙酰酶。（1） 大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。酶的阻遏：某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编码的基因的表达而进行的，这种

21、现象叫做酶合成的阻遏。证明实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失；（3）表明色氨酸的存在组织了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。4.4. 微生物生产酶的优点，产酶微生物的基本要求？微生物生产酶的优点，产酶微生物的基本要求？优点：微生物种类繁多：产酶微生物多；一种微生物产好几种酶；微生物繁殖快、生产周期短、培养方便；微生物易改造，可通过各种手段培育新种。基本要求：不是致病菌、安全可靠，无毒性；发酵周期短，产酶量高；不易变异退化；最好是产生胞外

22、酶的菌种，利于分离纯化。5.5. 可以通过哪些途径获得产酶微生物可以通过哪些途径获得产酶微生物从自然界中搜寻所需要的产酶微生物；从菌种保藏中心筛选；从基因库筛选6.6. 微生物发酵产酶的培养方式有哪些？微生物发酵产酶的培养方式有哪些？固体发酵的培养：以麸皮、米糠为主要原料，加入其他必要的营养成分，制成固体或半固体的麸曲后，进行发酵产酶。液体深层发酵：采用液体培养基，经灭菌、冷却后接种产酶菌，在一定条件下发酵产酶。固定化细胞发酵：将细胞固定在水不溶性的载体上，在一定的空间范围内进行生命活动而产酶。固定化原生质体发酵：利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外。7.7.分析提高微生物产酶量的方法有哪些分析

23、提高微生物产酶量的方法有哪些？（1）针对性地打破生物细胞内酶蛋白的合成机制，可从两方面入手：条件控制：发酵条件优化：控制温度、PH，优化培养基，根据需求供给无菌空气，掌控发酵周期，确定放罐时间，避免自溶。采用添加诱导物、解除阻遏物、流加等技术提高产酶量。（2）遗传控制：包括基因突变和基因重组。8.8. 什么是基因重组？构建基因工程菌的一般流程是什么？什么是基因重组？构建基因工程菌的一般流程是什么？根据人们预先设想，利用酶学的方法，将目的基因重组到一个适宜的载体上，组成重组子，将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，以达到改造生物细胞目的的技术。流程：目的基因片段的产生和分离；目的基因片段共价

24、连接到载体上，即体外重组；体外重组的杂合分子转入合适的宿主；筛选和检测。9.9. 设计一个实验方案从自然环境中筛选获得一株产设计一个实验方案从自然环境中筛选获得一株产- -淀粉酶的微生物，并获取其编码淀粉酶的微生物，并获取其编码- -淀粉酶的淀粉酶的基因。简述该实验方案的基本原理，并描述实验流程。基因。简述该实验方案的基本原理，并描述实验流程。PCR 扩增后测序获得基因序列第六章第六章 酶的分离纯化酶的分离纯化1.1. 酶提取、分离纯化的一般技术路线。酶提取、分离纯化的一般技术路线。2.2. 细胞破碎的方法及其原理。填空细胞破碎的方法及其原理。填空机械破碎通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞

25、破碎。捣碎法、研磨法、匀浆法；物理破碎通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法；化学破碎通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿，表面活性剂：Triton、Tween；酶促破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用， 使细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎。 自溶法、外加酶制剂法。3.3. 什么是盐溶？什么是盐析？什么是盐溶？什么是盐析？盐溶现象：大多数蛋白类酶都溶于水， 而且在低浓度的盐存在的条件下， 酶的溶解度随盐浓度的升高而增加， 称为盐溶现象。盐析：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶

26、解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。4.4. 酶沉淀分离的方法有哪些？盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀的原理。大题酶沉淀分离的方法有哪些？盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀的原理。大题盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法。盐析沉淀原理：利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离。等电点沉淀法原理： 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。有机溶剂沉淀原理： 利用酶与

27、其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。5.5. 什么是膜分离？膜分离的基本类型和截留的主要物质。什么是膜分离？膜分离的基本类型和截留的主要物质。膜分离： 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、 不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。基本类型： （1）加压膜分离：微滤、超滤、反渗透；微滤截留物质为尺寸大于 m 的微生物和微粒子，超滤截留物质为分子量在 500 以上的高分子，反渗透截留物质为小分子物质。（2）电场膜分离：电渗析、离子交换膜电渗析；阳膜截留阴离子，阴膜截留阳离子。（3）扩散膜分离：透析。截留

28、物质为大分子溶质。6.6. 什么是吸附层析？分配层析？离子交换层析？凝胶层析？亲和层析？层析聚焦？各自的分离依什么是吸附层析？分配层析？离子交换层析？凝胶层析？亲和层析？层析聚焦？各自的分离依据？据？吸附层析：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离。分配层析：利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。离子交换层析：利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到物质分离。凝胶层析：以各种多空凝胶为固定相，利用流动相中所含各组分的相对分子质量不同而达到物质分离。亲和层析：利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，是生物分子分离纯化。层析

29、聚焦：将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离。7.7. 对于某种酶制剂，如对于某种酶制剂，如- -淀粉酶，如何检查其是否达到预期纯化的精度要求？淀粉酶，如何检查其是否达到预期纯化的精度要求？计算酶活力和比活力、回收率、提纯倍数。回收率：提纯前与提纯后酶的总活力之比，表示提纯过程中酶损失程度大小。回收率越高损失越小提纯倍数：提纯前后比活力之比， 这是表示提纯过程中纯度提高的倍数。 提纯倍数越大， 表示该方法纯化效果越好。第七章第七章 固定化酶和细胞固定化酶和细胞1.1. 酶固定化是为了克服游离酶应用过程中的哪些缺点？酶固定化是为了克服游离酶应用过程中的哪些缺点？（

30、1） 酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，以及胃蛋白酶等可以耐受较低的pH 条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。（2） 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，酶在反应系统中与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。（3）产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混合在一起，无疑给产物的进一步分离纯化带来一定的困难。2.2. 什么是固定化酶？固定化酶的优点和缺点？什么是固定化酶？固定化酶的优点和缺点？固定化酶：在一定空间内呈闭锁状态的酶，能连续的

31、进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。优点： （1）不溶于水，易于与产物分离； （2）可反复使用； （3）可连续化生产； （4）稳定性好。缺点： （1）固定化过程中往往会引起酶的失活； （2）首次制备成本较高； （3）适用于可溶性底物，尤其可溶性小分子底物，对大分子不适宜。3.3. 酶固定化有哪些方法，优缺点？酶固定化有哪些方法，优缺点？（1）非化学结合法：物理吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。优点是操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可以反复使用。缺点是由于靠非化学吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到

32、一定的限制。离子结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 优点是条件温和，操作简单，制备过程中，活力损失较少。缺点是离子键结合力较弱，结合力不牢固，在pH 和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。（2）化学结合法：交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。优点是结合牢固，可长时间使用。缺点是交联反应条件较剧烈，酶分子多个基团被交联，酶活力损失较大；颗粒较小，使用不便。共价结合法：通过共价键将酶蛋白分子上的反应集团与载体表面反应基团结合，从而使酶固定化的方法。优点是结合牢固，固定化酶的稳定性好，利于连续使用，不会因为反应条件等原因轻易脱落。缺点是反

33、应条件苛刻，操作复杂；引起高级结构变化，破坏活性中心，不易得到比活力高的固定化酶， 酶活回收率较低；底物专一性会发生变化。（3）包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。优点是不与酶蛋白氨基酸残基结合，很少改变酶结构，酶活回收率高。缺点是包埋时化学聚合反应，易导致失活，只适用于小分子底物和产物体系。4.4. 与游离酶相比较，固定化酶的性质有哪些变化？与游离酶相比较，固定化酶的性质有哪些变化？（1） 酶活性的影响：酶活性下降，反应速率下降；（2） 酶稳定性的影响： 操作稳定性提高， 贮存稳定性比游离酶大多数提高， 热稳定性大多数提高但有些反而降低，对分解酶的稳定性提

34、高，pH 稳定性提高明显优于游离酶，对有机溶剂的稳定性提高；（3） pH 的变化：改变酶的空间构象，影响酶的催化基团的解离，影响酶的结合基团的解离，改变底物的解离状态（酶与底物不能结合或结合后不能生成产物） ；（4） 最适温度变化：随热稳定性的提高，最适温度随之提高，少数例外最适温度下降，活性或其他因素会改善；（5） 底物特异性变化：专一性会发生不同程度的变化，作用于小分子底物的酶特异性没有明显变化，既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶特异性往往会变化；（6） 米氏常数 Km 的变化，Km 值随载体性质变化：Km 升高，酶与底物的亲和力降低，带电载体与底物之间的静电作用会引起底物分子在

35、扩散层和整个溶液之间不均一分布。5.5. 什么是固定化细胞？什么是固定化原生质体？什么是固定化细胞？什么是固定化原生质体？固定化细胞：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞，该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢。固定化原生质体：细胞产生的许多代谢物不能分泌到胞外，细胞壁对物质扩散的障碍是其原因之一。除去微生物和植物细胞的细胞壁，就可以增加细胞膜的透过性，从而使较多的胞内物质分泌到细胞外，这个过程称为固定化原生质体。6.6.任意选择一种酶固定化方法，设计一个实验方案制备固定化任意选择一种酶固定化方法，设计一个实验方案制备固定化- -淀粉酶。淀粉酶。 （最后大题，要求写两种（最后大题

36、，要求写两种方案方案）第八章第八章 酶的修饰与改造酶的修饰与改造1.1. 酶分子修饰的概念及其意义？酶分子修饰的概念及其意义？通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。意义：提高酶的活力；增强酶的稳定性；降低或消除酶的抗原性；研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响。2.2. 酶分子修饰的方法有哪些，原理及优缺点？酶分子修饰的方法有哪些，原理及优缺点？金属离子置换修饰大分子结合修饰原理把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子， 使酶的特性和功能发生改变优点阐明金属离子对酶催化作用的影响；提高酶活力；增强

37、酶稳定性； 改变酶的动力学性质缺点只适用于在分子结构中本来含有金属离子的酶利用水溶性大分子与酶结合， 使提高酶活力；增强酶稳定性；需要选择适宜的水溶性降低或消除酶蛋白抗原性大分子作为修饰剂， 而且酶的空间结构发生某些精细的须经过活化改变， 从而改变酶的特性与功能可用于研究酶的结构和功能；可提高酶活力， 增强酶稳定性和降低抗原性； 可获得自然界不存在的新酶种会引起酶蛋白空间构象的改变侧链基采用一定的方法（一般为化学团修饰法） 使酶蛋白的侧链基团发生改变， 从而改变酶分子的特性与功能肽链有限水解修饰利用酶分子主链的切断和连接， 探测酶活性中心位置； 使原来提使酶分子的化学结构及其空间不具活力的酶原

38、显示活性；某些药用酶可消除结构发生某些改变， 从而改变酶高酶活力；抗原性的特性与功能会引起酶蛋白空间构象的改变， 需要专一性较高的修饰剂氨基酸置换修饰酶分子物理修饰将肽链上的氨基酸换成另一个氨基酸， 从而改变酶的特性和功能在不同物理条件下， 不改变酶的组成单位及其基团， 共价键不发生改变， 只有副键发生某些变化和重排， 来观察了解酶特性和功能的变化情况提高酶活力；增强酶稳定性； 难度大，成本高，专一性使酶专一性发生改变差， 逐个对酶分子进行修饰操作复杂， 难以工业化生产可以了解不同物理条件下由共价键不改变于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能改变情况；提高酶的催化活性、 增加酶稳定性或使酶

39、催化动力学发生改变3.3.什么是酶原激活？举一个例子说明酶蛋白的主链修饰什么是酶原激活？举一个例子说明酶蛋白的主链修饰( (肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰) )？某些酶在细胞内合成或初分泌时没有活性，这些没有活性的酶的前身称为酶原,使酶原转变为有活性酶的作用称为酶原激活。4.4.与天然酶比较，酶分子修饰后性质发生了哪些变化与天然酶比较，酶分子修饰后性质发生了哪些变化. .？热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性：比较公认的是 PEG 和人血清蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。半衰期：一般在体内的半衰

40、期得到有效延长。最适 PH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适PH 更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km 的变化：大多数酶经修饰后，Vm 没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km 值变大。5.5.什么是酶的体外定向进化，原理及一般流程。什么是酶的体外定向进化，原理及一般流程。酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为的创造特殊的条件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择） ，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。原理：在待进化酶基因的 PCR 扩增反应中，利用 TaqDNA 聚合酶不具有 3-5校对功能的性质，配

41、合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变， 构建突变库， 凭借定向的选择方法， 选出所需性质的优化酶 （或蛋白质） 。从而排除其他突变体。流程： 1 基因的选择： 选择编码所需蛋白质的 DNA 序列 2 突变或重组： 通过易错 PCR 引入随即突变或 DNA Shuffling等方法增加基因序列的多样性。 3 突变基因文库的构建：将获得的突变重组基因插入到表达载体中的构建突变库。4 突变体酶的表达：将载体转入受体细胞表达变异酶。 5 目的基因鉴定：利用筛选和选择方法确定有益的特性克隆。6 分离改良基因并重复上述过程，直至获得所需性质的蛋白质。6.6.酶体外定向进化过程中产生随机突变的策

42、略有哪些？什么是易错酶体外定向进化过程中产生随机突变的策略有哪些？什么是易错 PCRPCR？策略：易错 PCR，DNA 改组，外显子改组，杂合酶，PCR 体外随机引发重组，交错延伸，随机定向突变。易错 PCR 是在采用 Taq 酶进行 PCR 扩增目的基因时，通过调整反应条件，如提高Mg2+浓度，加入 Mn2+，改变体系中四种 dNTP 的浓度等，然后选择或筛选需要的突变体。第九章第九章 酶的非水相催化酶的非水相催化1.1. 酶非水相催化的类型有哪些？酶非水相催化的类型有哪些？有机介质中的酶催化；气相介质中的酶催化；超临界介质中的酶催化；离子液介质中的酶催化2.2. 有机溶剂介导的非水相生物催

43、化体系的类型？有机溶剂介导的非水相生物催化体系的类型？非极性有机溶剂酶悬浮体系（微水介质体系） ；与水互溶的有机溶剂水单相体系；非极性有机溶剂谁两相 /多相体系3.3. 什么是必需水？什么是必需水？维持酶分子完整的空间构象所必须的最低水量称为必须水。4.4. 有机介质酶催化反应的优点。有机介质酶催化反应的优点。（大题）（大题）1 酶在有机介质中由于水分子减少，相对来说酶分子的构象表现出比水溶液中更具有“刚性”特点。因而使通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性成为可能。 2由于引起没变形的许多因素都与水的存在有关，因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高。 3由于有机溶剂的存在，水量减少， 大大

44、降低了许多需要水参与的副反应，如酸酐的水解，酰基转移等。 4在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程，提高收率。5.5. 举例说明有机介质中酶催化反应的具体应用。举例说明有机介质中酶催化反应的具体应用。第十章第十章 酶抑制剂酶抑制剂1.1. 什么是酶失活作用？什么是酶抑制作用？什么是酶去激活作用？什么是酶失活作用？什么是酶抑制作用？什么是酶去激活作用？失活作用是指由于一些物理因素或化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。抑制作用指一些化合物能够与酶的必需基团结合，改变必需基团的结构和性质，酶未发生变性，从而引起酶活性的下降，甚至使酶的活性完

45、全丧失。去激活作用：某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也会引起这些酶活性的降低或丧失，去激活作用通过去除金属离子而间接地影响酶的活性。当金属离子去除后，底物与酶的结合减少，实际上是降低了底物的有效浓度。2.2. 什么是不可逆抑制剂？什么是可逆抑制剂？如何区分这两种抑制类型？什么是不可逆抑制剂？什么是可逆抑制剂？如何区分这两种抑制类型？不可逆抑制剂:抑制剂与酶的必需基团以共价形式结合，引起酶活性丧失。不能用透析、超滤等物理方法解除抑制而使酶恢复活性。可逆抑制剂：抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。区分：

46、1 物理方法：用透析、超滤和凝胶过滤等方法是否能除去抑制剂来鉴别可逆抑制作用和不可逆抑制作用。 2动力学方法：在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂，测定酶反应的初速度，以初速度和酶浓度作图区别。3.3. 什么是竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制？各自的特点？什么是竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制？各自的特点？竞争性抑制：某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合，当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制。特点：1 竞争性抑制剂多是酶的底物类似物或反应产物；2 抑制剂与底物竞争与酶结合，多于酶的活性中心同底物结合的基团结合；3 底

47、物浓度增加时，抑制作用减弱，取决于底物浓度与抑制剂浓度的比例及其与酶的亲和力的大小，可通过增加底物浓度的方法消除抑制作用；4 动力学参数：Km 值增大，Vm 值不变。非竞争性抑制：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导致酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制。（名词解释）特点：1 非竞争抑制剂的化学结构不一定与底物分子结构类似； 2 底物和抑制剂分别独立的与酶的不同部位相结合；抑制剂是与酶的活性中心以外的必需基团结合而起作用的；3 抑制剂对酶和底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；抑制作用只取决于酶浓度、抑制剂浓度和Ki 的大

48、小；4 动力学参数：Km 值不变。Vm 值降低反竞争性抑制：酶与底物结合后抑制剂才能和酶结合，反竞争性抑制作用常见于多底物反应。特点：1 反竞争抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；2 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；3必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加； 4 动力学参数：Km 减小，Vm降低4.4. 微生物来源的酶抑制剂筛选的一般步骤？微生物来源的酶抑制剂筛选的一般步骤？微生物的分离；筛选模型的建立；发酵条件的确定；抑制剂的分离、鉴定第十一章第十一章 现代酶学现代酶学1.1. 请描述请描述 RibozymeRibozyme 的发现以及意义。

49、核酶的分类？什么是脱氧核酶？的发现以及意义。核酶的分类？什么是脱氧核酶？发现：核酶是美国科学家 Cech 和 Altman 发现的具有酶的特异性催化功能的一类 RNA。20 世纪 80 年代，美国科学家 Cech 等人在研究四膜虫 RNA 时， 首次发现 rRNA 中 I 型内含子具有自我剪接功能， 随后， Altman 和 Pace 以及 Cech几个实验室又陆续发现了真正的RNA 催化剂，其中 L19RNA 和核糖核酸酶 P 的 RNA 组分是两个最具有说服力的例子。意义： （1）打破了生物催化剂只有蛋白质一家的传统观念，给今后生命的人工合成提供了一个重要的信息；（2）给生命起源和演变提供

50、一个新的线索； （3）将酶的概念拓展为：酶是具有生物催化功能的一类大分子，包括蛋白质或RNA。分类： （1）剪接型核酶：I 型内含子、II 型内含子（2）剪切型核酶：自体催化的有锤头核酶、发夹核酶、丁型肝炎病毒核酶；异体催化的有RNaseP。脱氧核酶：具有酶活性的DNA 分子称为脱氧核酶。2.2. 什么是抗体酶？有什么特点？抗体酶制备的方法及其原理？什么是抗体酶？有什么特点？抗体酶制备的方法及其原理？抗体酶：具有催化能力的免疫球蛋白称为催化抗体，即抗体酶。特点： （1）与配体结合的专一性； （2）具有高效催化性； （3）具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH 依赖性等；（4）一种对酶促反应过渡