细胞周期检测-protocol(3页).doc

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1、-细胞周期检测-protocol-第 3 页碘化丙啶（propidium iodide, PI）检测凋亡细胞早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。主要操作步骤如下：组织块用0.25%胰酶消化30min1h。200400目筛网过滤细胞，获得单细胞

2、悬液。75乙醇（-20预冷）固定细胞1h。加入PI（终浓度50gmL）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50gmL）1mL染色30min1h。流式细胞仪检测细胞周期和凋亡细胞凋亡情况观察及凋亡率检测 培养48h后细胞分为两部分，一部分行碘化丙啶( pI )染色，倒置相差显微镜下观察细胞核形态变化。另一部分以胰酶消化后收集， 以1800rmin离心5min，弃培养基，用4预冷的PBS洗细胞2次，离心去PBS，加入 4预冷的70的乙醇 4固定1h，离心弃去固定液， 用 4预冷PBS 3ml 洗细胞2次，加人1ml PI，4避光30mi n 。采用流式细胞仪检测凋亡率。 流式检测细胞周期要点： 最关

3、键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备！1、细胞消化要理想，资料显示最好消化时加EDTA，可使流式做的很漂亮；2、细胞消化后不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞容易破碎；3、 细胞用PBS洗涤离心，转速不超过1000r/min，有文献用800r/min；可考虑在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞（有人主张用钢网，以 减少细胞与尼龙网粘连的损失，本人认为钢网易损伤细胞，DNA外溢也会造成细胞粘连，所以在细胞数足够的情况下，首选尼龙网）；4、离心后的固定，标准做法是将细胞悬液加入预冷70酒精，而不是向细胞中加酒精，这样是为了减少细胞聚集，这一点很重要，很多人都忽视

4、了！5、一般选择4固定过夜；6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题；7、 关于PI染液的组成及配方，应主要以文献为主，PI（作用为DNA染色剂）的浓度从0.5g/ml,20g/ml，到50g/ml都见报道，响应的 求助显示都可出良好结果，RNAs酶（由于PI也可染RNA，故要去除RNA）一般浓度为50g/ml，配方中的Triton-X-100（曲拉通）主 要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。8、检测时细胞要达到12106个细胞（实际检测是1万到2万个细胞），为了既保持初始条件相同，又可搜 集到足够的细胞，应选用多孔培养板，在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。如果

5、细胞数量太低，技师为了减少对流式细胞仪 的损伤，就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小），检测的质量就会大大下降，数据的说服力就下降了！画两个点图：FSC/SSC、FL2-W/FL2-A，画两个直方图：FL2-H、FL2-A。 将FL2的阈值设在20。 选择FL2做为DDM参数（区分细胞粘连的参数）。 将FL2设为LIN模式。线性模式有利于区分G0/1和G2/M期细胞。 将FL2、FL2-A、FL2-W的倍增（Amp）设置为1.00。 样本上机，以低速（LOW）获取细胞，低速可保证细胞之间的差异尽可能的小，保证更高的精确度。 调整FSC、SSC、FL2的电压，使FL2-A直方图上G0/1峰

6、值在200，使FL2-W直方图上的细胞群大部分位于200至600之间。流式步骤：取对数生长期细胞，常规消化制成单细胞悬液，以1.25 105/ml密度接种于T-25培养瓶中，24h后加入各浓度消癌平注射液(10, 20, 40mg/ml)培养24h，收集所有细胞，将约1106个细胞移入离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清后，用PBS溶液清洗一次，在离心管中留约0.5mlPBS，加入70冰乙醇5ml混匀固定，4放置48h以上。检测时，离心离去乙醇，PBS清洗一次，在离心管中留1mlPBS，打散细胞团，加入Rnase5ul(10mg/ml)，37放置1h，加入PI（100ug/ml）染液，室温避光染色30分钟，计数10000个细胞，流式细胞仪检测细胞周期时相和凋亡情况，进行细胞凋亡的分析，亚Go/G,峰为凋亡细胞峰。