酶学与酶工程(15页).doc

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1、-酶学与酶工程-第 14 页Lecture1 酶学与酶工程1、酶的概念，命名、酶的活性中心1）酶是由活细胞产生的，具有催化活性和高度转移性的特殊蛋白质，是一类生物催化剂。酶工程：将酶学理论与化工技术相结合，研究酶的产生和应用的一门新的技术性学科，包括了酶制剂的制备、酶的固定化、酶的修饰与改造及酶反应器等方面。主要:酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和酶生物反应器。化学酶工程：用化学手段修饰、改造、模拟天然酶，使其更适合人们的需要，主要包括天然酶、化学修饰酶、固定化酶以及化学人工合成酶的研究与应用。生物酶工程：用生物学的方法，特别是基因工程、蛋白质工程和组合库筛选法改造天然酶，创造性能优异的新酶

2、，主要是抗体酶、杂合酶、进化酶和核酸酶的研究与应用。2）命名：系统命名法！催化下列反应酶的命名：ATP+D葡萄糖ADP+D葡萄糖-6-磷酸 该酶的正式系统命名是：ATP：葡萄糖磷酸转移酶，表示该酶催化从ATP中转移一个磷酸到葡萄糖分子上的反应。它的分类数字是：代表按国际酶学委员会规定的命名第1个数字(2)代表酶的分类名称(转移酶类)第2个数字(7)代表亚类(磷酸转移酶类)第3个数字(1)代表亚亚类(以羟基作为受体的磷酸转移酶类)第4个数字(1)代表该酶在亚-亚类中的排号(D葡萄糖作为磷酸基的受体）3）活性中心必需基团：酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基因酶的活性中心：

3、必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。2、酶的分类、组成、结构特点和作用机制分类：按酶促反应的性质分类（六大类）：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶类、异构酶类、合成酶类全酶=酶蛋白+辅因子辅因子包括：有机辅因子（辅酶非共价结合/辅基非共价结合或共价结合）和金属辅因子（金属酶/金属激活酶）酶蛋白的分类：单体酶、寡聚酶仅有一个活性中心的酶；一条/多条多肽链组成，分子量相对小。多酶复合体体内一些酶聚合在一起，组成一个物理的结合体；第一个酶的产物可以成为第二个酶的底物。多功能酶在酶分子中存在多种催化活性的部位；相关的化学反应在一个酶分子上进行。

4、3、酶作为催化剂的显著特点强大的催化能力：可以加快至1017倍；没有副反应，酶在较温和的条件下催化反应的进行；高度的专一性，各种酶都有专一性但是专一程度的严格性上有所差别；可调节性，包括了抑制剂和激活剂的调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等；易变性，大多数的酶是蛋白质，在极端环境中会受到破坏。4、酶活力的调节调节对象：关键酶！一般位于代谢反应途径的起始或分支位点；催化单向不可逆反应；活性较低（限速酶）；是可调节酶。方式：酶活性的调节快速 酶含量的调节缓慢（两种方法：同工酶/控制酶基因的表达和酶分子的降解）酶的质变：酶原调节，变构调节，共价调节酶原调节：避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化

5、，使得酶在特定的环境中发挥作用；另外酶原可以认为是酶的储存形式；水解激活是不可逆的。变构调节：代谢物可以和酶分子活性中心之外的部位可逆性的结合，使酶的构象发生改变，从而改变酶的催化活性。这类酶一般具有四级结构，存在协同效应/含有催化亚基和调节亚基。共价修饰：酶蛋白肽链在其他酶的催化下，化学集团可以与酶发生可你的共价修饰，影响了酶的活性。PS：磷酸化与脱磷酸化等。（有级联效应）5、核酶的概念及核酶的应用核酶：化学本质是RNA，催化底物包括RNA、DNA、肽键等，还有的具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。具有反应特异性识别碱基；核酶的催化效率比较低是一种较为原始的催化酶。PS：核酶是金属依赖酶（特异的

6、结构作用；促进RNA分子的折叠；参与过渡中间复合物的形成）作用：核苷酸转移作用；水解反应，磷酸二酯酶作用；磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用；脱磷酸作用，酸性磷酸酶作用；RNA内切反应，RNA限制性内切酶作用。脱氧核酶：利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段，称为酶性DNA。（根据催化功能的不同可以分为五大类：切割RNA的脱氧核酶、切割DNA的脱氧核酶、具有激酶活力的脱氧核酶、具有连接酶功能的脱氧核酶、催化卟啉环金属螯合反应的脱氧核酶）应用：1）核酶可以特异性地识别并结合目标基因，使其断裂失活，从而阻断或降低目标基因的表达，起到基因沉默的作用；2）核酶不会对

7、细胞基因组产生任何副作用，因而可以作为安全有效的分子生物学工具；3）可以应用于基因治疗核酸酶：指所有可以水解核酸的酶，本质为蛋白质。在细胞内催化核酸的降解。可分为DNA酶和RNA酶；外切酶和内切酶；其中一部分具有严格的序列依赖性，称为限制性内切酶6、同工酶的概念原级同工酶：同一种属中由不同基因或（复）等位基因编码的多肽链多组成的单体、纯聚体或杂交体，其理化及生物学性质不同而能催化相同反应的酶称为同工酶。不同基因可以是在不同染色体或在同一染色体的不同位点上，分子结构差异，彼此间无交叉免疫。次生性同工酶：由同一基因、同一mRNA转译生成原始的酶蛋白，再经过不同类型的共价修饰（如糖基化等）而造成的多

8、种酶分子形式，严格来说不属于同工酶而称为次生性同工酶。Lecture2 酶促反应1、酶促反应的特点和机理：极高的效率；特异性（绝对特异性、相对特异性、立体结构特异性）；作用条件温和；具有可调节性。2、三个假说：锁匙假说关于专一性的假说之一；1894年费歇尔提出；酶与底物的结合方式可用锁匙结合（多位点结合）假设做出解释；酶是刚性结构的。诱导契合假说1959年提出；底物与酶结合时，酶分子上某些基团发生明显的变化；酶的活性中心是柔软的。E+SESE+P中间络合物假说Henri和Wurtz提出；底物浓度与反应速度的关系时发现。酶的高效催化是由于酶首先与底物结合生成不稳定的中间产物，然后释放反应产物和酶

9、。3、酶促反应动力学：1）影响酶促反应的因素，Km值的意义Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一般时的底物浓度；Km表示酶与底物分子的亲和力，值越大亲和力越小。当反应条件恒定时，Km只和酶及底物的性质有关，与酶的浓度无关；一种酶能催化几种底物时就有不同的Km，其中Km最小的底物一般认为是该酶的天然底物或最适底物；分辨同工酶：测定几个同工酶对同一底物的Km，可估计这组同工酶是原级同工酶还是次生性同工酶，前者的Km常有差异，后者的则比较接近或相同。有助于寻找限速步骤；在进行生化试验时根据米氏公式计算工具酶的用量。2）有哪些抑制类型，与Km之间的关系不可逆性抑制作用抑制剂以共价键与活性中心的必需基团

10、相结合使酶失活；常见不可逆抑制剂：碘乙酸、有机磷化物分为Ks和Kat两大类可逆性抑制作用竞争性抑制抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。Vmax不变，表观Km非竞争性抑制抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系。酶-底物-抑制剂复合物ESI不能进一步分解产生产物 Vmax，表观Km不变。 反竞争性抑制抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使ES的量下降。酶-底物-抑制剂复合物ESI不能进一步分解产生产物，常见于多底物反应中； Vmax，表观Km酶抑制剂的应用：医学上：青霉素类药物的应用农业生产上：农药杀虫的机理抑制生

11、物体中的靶酶；工业上的应用：食品加工过程中使用金属螯合剂抑制多酚氧化酶。4、影响酶促反应的因素：1) 底物浓度2) 酶浓度3) 温度4) pH5) 激活剂（必需激活剂/非必需激活剂）6) 抑制剂（使酶的催化活性下降但不引起变性的物质）5、酶活性的测定和酶活性单位酶的活性单位：在规定条件下，酶促反应在单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。国际单位,在特定条件下，每分钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位。催量单位，在特定条件下，每秒钟使1mol底物转化为产物所需要的酶量。1IU=16.6710-9kat方法：选择适宜的底物确定酶催化反应的温度，pH值，底物浓度，

12、激活剂浓度等反应条件在一定条件下，将一定量的酶与底物混合液混合均匀，适时记录反应开始的时间反应到一定时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，检测产物的生产量和底物的减少量Lecture 3 基因工程的酶学基础&基因克隆表达的过程1、基因克隆常用的酶、应用及注意事项2、重组DNA技术操作的主要步骤3、酶工程：酶的生产、改性和应用的技术过程Lecture3 ZFN、TALEN、CRISPER技术原理及优缺点ZFN锌指蛋白+Fok1识别DNA的酶和Fok1核酸内切酶锌指蛋白结构域负责识别靶位点, 依赖FokI的作用打DNA双链, 从而造成双链断裂，断开的双链DNA在修复过程中会发生碱基的缺失、

13、插入、同源交换等突变。不是任意三联碱基组合都有对应的模块；上下文效应；脱靶现象严重；难度大TALENTALEN蛋白+Fok1TALE的核酸识别单元为间隔32个恒定氨基酸序列的双连氨基酸（RVDs）。RVDs与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NG识别T， HD识别C， NI识别A， NN识别G/ATALE的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。无基因序列、细胞、物种限制。毒性低、脱靶情况少。成对的TALE识别模块保证了基因敲除靶点的准确性。CRISPER靶向要求：PAM为NGG如果目标序列不存在PAM,则不可用。仅需十余

14、个碱基的精确配对，降低切割特异性。是一种原核系统，针对真核细胞中染色体的各种修饰结构是否能够无差别的进行高效的切割还需要进一步探究。和ZFN及TALEN一样，存在双链断裂之后非同源末端连接修复可能随机产生细胞毒性的问题。只需要合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具有特异性；编码sgRNA的序列小；细胞毒性小，脱靶率低，便于操作和调节。Lecture5 酶的发酵生产Lecture6 酶的分离纯化了解酶在细胞中的分布胞外酶：由细胞产生后分泌到胞外发挥作用的酶，大部分属于水解酶，通常含量高容易得到。细胞内酶：在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，该类酶在细胞内往

15、往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性6.2 材料的获取微生物作为酶源的优越性：价格低廉，产量高；容易培养和管理：生长迅速，适应性强 ；产酶稳定性好；利于分离纯化。分离纯化的技术路线：离心分离：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程要根据欲分离物质以及杂质颗粒大小密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。过滤与膜分离：非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 电泳分离：纸电泳用滤纸作为支撑介质多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速

16、，便于保存琼脂糖凝胶电泳一般用于核酸的分离分析聚丙烯酰胺凝胶电泳核酸和蛋白质的分离纯化及检测，分辨率较高酶的浓缩蒸发浓缩超滤浓缩浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的吸水浓缩利用葡聚糖凝胶的吸水特性，干胶直接加入样品溶液，吸水嘭润后在过滤或离心。聚乙二醇PEG反复冻融浓缩利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。沉淀法盐析法，有机溶剂法酶的干燥酶的结晶常用的结晶方法是：透析平衡结晶法将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。 纯化方案的设计与评价纯化方案的设计（一）纯化

17、方法的选择依据1、根据有效成分和杂质之间理化性质的差异调节溶解度：沉淀法2、根据分子大小、形状的不同： 离心分离，膜分离，凝胶过滤2、根据分子电荷性质的不同： 离子交换层析，电泳4、根据专一性结合的方法：亲和层析5、其它：吸附层析，疏水层析（二）纯化方法的排序先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。纯化方案的评价酶的定量并非是对按白虎进行定量而是对它的催化能力进行定量；所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶的促反应速度。酶活力的测定：在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行

18、分析，求得单位时间的酶促反应变化量。常用的方法 ：化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液 。分光光度法：利用底物和产物光吸收性质的不同 。量气法：酶促反应中产物或底物之一为气体。滴定法（pH值测量法）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。多用pH电极测。提纯倍数与回收率：每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数 酶比活力=酶活力单位数/酶蛋白质量纯化倍数=提纯后比活力/提纯前比活力（方法的有效程度）总活力=酶活力单位数*酶液总体积回收率=提纯后酶总活力/提纯前酶总活力100%（反应酶的损失情况）Lecture7 酶的修饰1.原因天然酶的缺陷易于变性失活；酶的活性不够；容易受产

19、物和抑制剂的影响；工业生产的条件达不到酶的最适反应条件；底物不溶于水或者酶的米氏常数过高；酶作为药物在体内的半衰期等因素限制酶制剂的应用；具有抗原性。2.化学酶工程通过分子修饰的方法改变已分离出来的天然酶的活性定义：对酶在分子水平上用化学方法进行改造，在体外通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术。目的：研究结构与功能的关系；改变天然酶的性质扩大酶的应用范围；提高酶的生物活性；增强酶的稳定性；消除酶的抗原性；产生新的催化能力。原理：增强稳定性和耐热性交联产生刚性结构；“遮盖”酶的活性部位；减少蛋白水解酶的破坏的可能性 抗原决定簇的破坏

20、或者“遮盖” 大分子修饰剂形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境的相对稳定。要求和条件：在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及没血性质等方面都要有足够的了解：酶的稳定性（热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH等）；酶活性中心的状况（活性中心基团、辅因子等）。 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，尽量不破坏酶活性功能的必须基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高：pH与离子强度；修饰反应的温度与时间；反应体系中酶与修饰剂的比例。化学修饰方法：金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。阐明金属离子对酶催化作用的影响；提高酶的催化效率

21、；增强酶的稳定性；改变的动力学特征大分子结合修饰利用水溶大分子与酶的侧链基团结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能。提高酶的催化效率；增强酶的稳定性；消除酶的抗原性侧链基团修饰通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定功能基团发生化学反应荧光试剂进行修饰，了解在溶液状态下酶分子的构象；研究各种基团对酶分子的结构，特性和功能的影响；测定某一集团在酶分子中的数量。亲和修饰试剂作用于被修饰部位的某一基团，但不与被作用位点以外的同类基团发生作用专一性地标记与酶的活性部位上，使酶不可逆失活，也称为专一性的不可逆抑制化学交联用双功能基团试剂（戊二醛），与酶分子内不同肽链部分共

22、价交联，使酶分子空间构象更加稳定。固定化酶或修饰酶改变酶的生物化学性质和免疫学性质。固定化修饰通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适pH、温度和稳定性发生变化。酶化学修饰的设计：对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条件以及侧链基团的性质等；对修饰剂的选择的考虑：分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性；修饰剂上反应基团的数目及位置；修饰机上反应集团的活化方法和条件；（选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性条件下进行；所标记的残基在肽链中稳定以易于分离鉴定；修饰反应的程度能简单测定）选择酶反应条件要注意：反应体系的溶剂性质、盐浓度、

23、pH、温度等；酶与修饰剂的比例。（不造成蛋白质的不可逆变性；有利于专一性修饰；温度、pH、反应介质和缓冲液；修饰剂专一性）局限性：化学修饰的专一性是相对的；化学修饰后的酶的构象多多少少有一些改变，不利于对构象和功能关系的解释；只能发生在具有极性氨基酸残基侧链上；化学修饰法研究酶结构与功能关系缺乏准确性和系统性。3.酶分子的物理修饰通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的改变情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只在物理因素下，副键发生某些变化和重排。4.生物酶工程通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶目的定义

24、：将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。方法：酶蛋白主链修饰（酶切/酶原激活法）利用酶分子主链的切断和连键，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变从而改变酶的特性和功能的方法变性、诱导与构象重建酶肽链变性松散后，使其在有底物类似物或抑制剂存在的非天然条件下复性，酶将折叠成所需要的特殊结构，产生新的性状。生物酶工程：克隆酶通过基因工程手段，克隆各种天然酶的基因，将其克隆到表达载体中，然后将表达载体转化到适当的宿主中，得到表达特定酶的基因工程菌，通过基因工程菌的繁殖大量产生的酶称为克隆酶。突变酶有控制地对天然酶基因进行剪切、修饰或突

25、变，从而改变这些酶的催化特性、底物专一性或稳定性，使之更加符合人们的需要。定点突变：盒式诱变、寡聚核苷酸引物诱变、PCR诱变体外定向进化：合理设计、定向进化易错PCR/DNA改组杂合酶Lecture8杂合酶杂合酶的概念把来自不同酶分子的结构单元（单个功能域、二级结构、三级结构或功能域）或酶分子进行组合或交换，可以产生具有所需性质的优化酶杂合体。优化酶的结构，提高酶功能的手段意义：杂合酶可用于改变酶学或非酶学性质，是了解酶的结构-功能关系以及香瓜酶的结构特征的有力工具；可以扩大天然酶的潜在应用，甚至可以产生催化自然界不存在的反应的新酶分子；杂合酶方法的有效性和实用性已经得到了实验的证实。杂合酶的

26、构建方法构建基础：蛋白质的功能不为可以从一个蛋白质转移一道另外一个蛋白质上，同时保持结构的完整性，并获得新功能。不同蛋白质之间被交换的成分可以是个别残基、二级结构成分、整个亚结构或整个蛋白质。为了保留相同的基本功能，又具有修饰的性质通常在同喜功能单位间交换较短的成分，另外还可吸收两个或更多的功能单位易产生双功能蛋白质或多功能蛋白质。构建方法：1) 非合理性设计法：主要通过构建各种库，再从库中筛选出所需性质的杂合体2) 理性设计法：要求对所操作对象的结构和功能详尽的了解，才能实现结构元件从一个蛋白转移至另一个蛋白质，从而产生性能新奇的杂合体。点突变及二级结构互换功能域替换或转移功能域部位转移到具

27、有天然结构的骨架上，是产生新结合活力和新催化活力的“合理方法”活性部位转移到同系蛋白上转移活性部位到一个新的结构上功能域的交换功能域为杂合酶的构成组件，可通过交换获得具有催化特性的酶功能域与结构域的融合DNA限制内切酶：识别结构域+非特异性DNA裂解结构域Overlap PCR & 酶切连接的方法杂合酶的应用1) 非催化特性的改变种间杂交高度同源酶之间的杂交某一酶的催化特性授予另一酶2) 创建新催化活性酶调整现有酶的特异性或催化特性（单一氨基酸的变化；功能性结构域的交换）向结合蛋白引入催化残基向蛋白骨架引入特定功能的催化和结合结构域3) 产生双功能或多功能蛋白质把编码两个功能蛋白质的基因末端融

28、合，从而产生融合蛋白，因此也可把这一途径产生的酶看做杂合酶。4) 确定蛋白质的结构与功能的关系杂合酶常常被用来确定相关酶之间的差异,表征给予酶特殊性质的那些残基或结构，一种酶具有这种特殊性质，而另一种同系酶则不具备。极端酶极端微生物与极酶在超常生态环境条件下生存的微生物。它们对极端环境具有强的适应性，极端微生物基因组的研究有助于从分子水平研究极限条件下微生物的适应性，加深对生命本质的认识。极端酶来自极端微生物可以在极端环境下行使功能；极大地拓展酶的应用空间，是建立高效率、低成本生物技术加工过程的基础；极端微生物的研究与应用将是取得现代生物技术优势的重要途径，其在新酶、新药开发及环境整治方面应用

29、潜力极大。极端酶的制备1) 天然极端酶的筛选和生产：极端环境中采样，辅基，分离极端细菌，在通过特定的标记筛选极端酶2) 蛋白质工程生产极端酶：从极端环境中收集DNA,随机切割成DNA片段，再插入寄主细胞进行表达，提高筛选效率；利用基因重组技术，将极端酶的基因进行克隆，并进行序列测定，进一步探讨酶的构效与功能的关系。3) 宏基因组：基因提取纯化特定DNA进行克隆插入载体导入宿主细胞序列和功能筛选原位裂解法&异位裂解发8.2.3极端酶的应用抗体酶抗体酶的理论基础过渡态理论：认为酶与底物的结合经历了一个易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应所需要的活化能。抗体酶的设想：能与化学反应中过渡态结合的抗

30、体，可能具有酶的活性，催化反应的进行。具有催化能力的免疫球蛋白称为催化抗体。抗体酶的概念和特点1) 具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性，是抗体的高度选择性和酶的高校催化能力结合的产物；2) 能催化一些天然酶不能催化的反应3) 具有更强的专一性和稳定性抗体酶的制备1) 诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。2) 拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。3) 引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。4) 化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。应用前景戒毒、肿

31、瘤治疗噬菌体展示技术原理即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因。基于生物分子与药物靶分子（抗体、受体、抗原、酶的底物等）的亲和力，应用噬菌体表面展示技术可以从多肽库中进行快速筛选，从而成为药物开发的强有力工具。是一种对多肽功能非常有效的筛选技术。Lecture9 固定化酶和固定化细胞1.为什么？酶虽然具有高的催化效率和专一性的优点但是它对于反应环境十分敏感，容易失活，不能回收等缺点。固定化生物催化剂具有底物产物分离、能回收并反复使用、

32、易于连续化和自动化生产的优势。Lecture10 酶蛋白的稳定性和稳定化1.酶的稳定性酶的稳定性是指酶抵抗各种因素的影响，保持其生物活力的能力；要保持其生物活力，必须保持其空间结构。2.蛋白质稳定性的分子原因金属离子、底物、辅因子和其他低分子量配体的而结合作用。结合了多肽链的不稳定部分，显著增加蛋白质的稳定性。蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物，从而显著增加蛋白质稳定性蛋白质的疏水作用，水中蛋白质折叠的时候总是倾向于将疏水基团埋藏在分子内部，将亲水基团暴露在外部。次级键的存在能够维持蛋白质的二级结构，但对酶蛋白的稳定性影响不大。二硫键：大分子内的额分子交联可增强其坚实性，并提高在溶液中的

33、稳定性。对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低也可以增加蛋白质的稳定性，ps氧化作用是蛋白质失活的常见机理之一。蛋白质残基的坚实装配：水分子从空隙中除去，蛋白质结构变得更坚实，蛋白质的稳定性也增加，因此蛋白质的坚实化可作为一种认为稳定蛋白的方法。3.蛋白质不可逆失活的原因和机理蛋白水解酶和自溶作用聚合作用，蛋白质的聚合分三步：聚合分三步进行：N U A As（其中N U代表可逆伸展，A是聚合的蛋白质，As是发生了二硫交换反应的蛋白质聚合物。）极端PH：在强酸、中性和碱性pH下容易发生天冬酰胺和谷氨酰胺的脱氨作用，结果在蛋白质的疏水性内部引进入负电荷，导致酶失活氧化作用：各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨

34、基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基表面活性剂和去污剂：去污剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用，导致蛋白质不可逆变性变性剂：脲和盐酸胍（消除蛋白质三级结构中疏水作用）；高浓度盐；螯合剂（EDTA）重金属和巯基试剂：重金属催化水解二硫键/巯基试剂通过还原二硫键使酶失活。热：酶可逆热伸展使它的反应基团和疏水区域暴露，随后相互作用导致不可逆失活机械力：压力等机械力使蛋白质变性常伴随着不可逆失活的聚合或共价反应。冷冻和脱水：在冷冻过程中，溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈改变。辐射作用4.酶的稳定化方法：1) 固定化2) 非共价修饰反相胶团：是由两性化

35、合物在占优势的有机相中形成的。反相胶团不仅可以保护酶，还能提高酶活力，改变酶的专一性。添加剂：专一性的底物和配体、非专一性的中性盐和多羟基化合物、与酶失活剂竞争的物质或除掉破坏化学反应催化剂的物质。蛋白质间的非共价修饰3) 化学修饰：可溶性大分子修饰酶小分子修饰酶Lecture11 酶的非水相催化1.有机介质反应体系：1) 非极性有机溶剂酶悬浮体系用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。2) 与水互溶的有机溶剂水单相体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶

36、液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中3) 非极性有机溶剂水两相/多相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶剂相；采用固定化酶，则以悬浮形式存在两相的界面。催化反应通常在两相的界面进行4) 正、反胶束在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界面中进行在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活

37、性剂后形成的油包水的微小液滴。表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。反应时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部。催化反应在两相的界面中进行Ps：不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。他们对于催化反应有着显著的影响。水对催化反应的作用：酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量有机溶剂对酶催化的影响：底物特异性：极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易反应；极性较弱的有

38、机溶剂中，疏水性较弱的底物容易反应。立体选择性：酶在水溶液中催化的立体选择性较强，在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差区域选择性：酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性，即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。键的选择性：酶在有机介质中进行催化的另一个显著特点是具有化学键选择性热稳定性：许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。与介质中的水含量有关，随着介质中水含量的增加，其热稳定性降低PH特性：酶在有机介质中催化反应的最适pH值通常与酶在水溶液中反应的最适pH 值接近或者相同。通过控制缓冲液中pH值的方法，达到控制有机介质中酶催化反应的最适pH值。2.有机介质

39、中酶催化反应的条件及其控制：1) 酶的选择：随着酶浓度的升高而升高，两者成正比。还要特别注意酶的稳定性、底物专一性、对映体选择性、区域选择性、键选择性等。通过实验进行选择酶。2) 底物的选择和浓度控制：酶在所使用的有机介质中的专一性选择适宜的底物。底物的浓度对酶催化反应速度有显著影响3) 有机溶剂的选择：选择极性在25的溶剂4) 水含量的控制：确定体系的最适含水量5) 温度控制：最适温度高于在水溶液中催化的最适温度，要经过实验确定6) PH值的控制：通过调节缓冲溶液PH和离子强度进行调节控制。lecture12酶反应器1.什么是酶反应器：以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置称为酶反应器。

40、提供酶催化反应的场所，并提供合适的反应条件。以尽可能低的成本，按一定的速度由规定的反应物制备特定的产物酶反应器是生物反应器的一种。在低温、抵压下发挥作用，反应时的耗能和产物较少。是连键原料和产物的桥梁。2.酶反应器的要求：生物催化剂应具有比较高的比活和浓度，以达到最大转化率；具有良好的传质和混合性能；能用电脑自动检测和调控从而获得最佳的反应条件；应具有最佳的无菌条件，避免受到杂菌污染。搅拌动力消耗大；固化酶的结构容易受到剪切力影响而破坏温度和ph难以控制；清洗和更换部分固化酶较麻烦；床内有自压缩倾向，易堵塞；床内压力较大，底物必须在加压下才能进入需保持一定的流速，运转成本高；颗粒处于流动状态，

41、易导致离子的机械破损；流化床的空隙体积大，酶的浓度不高；流体动力学变化的，参数复杂，难于放大 酶易在膜上吸附损失；膜会因为污染或微孔堵塞而导致工作能力下降；放大成本高昂3.酶反应器的类型和比较：4.酶反应器的选择：（1）酶的应用形式：游离酶：回收困难，使用连续搅拌罐式反应器固化酶：颗粒状或者片状CSTR PBR 膜状或者纤维状PBR 消颗粒状FBR（2）底物的性质溶解性物质任何类型反应器/颗粒物质或者胶体物质CSTR、PBR（3）反应操作要求：（4）酶的稳定性固化酶在反应器中催化活性的损失可能有：酶本身的失效、酶从载体上脱落、酶的肢解其中CSTR最容易引起这类损失！（5）应用的可塑性及成本CS

42、TR类型的反应器的可塑性较大，结构简单，成本较低！5.酶反应器的操作反应温度的确定和调控根据酶的动力学特性，确定酶的催化最适温度。将反应温度控制在适宜温度范围内，在温度发生变化时，及时进行调节。夹套、列管等换热装置。PH值的确定与调控根据酶的动力学特性，确定最适PH。分批式反应器，通常在加入酶液之前，用稀酸或稀碱调节底物浓度到最适PH；连续式反应器，一般将调节好PH的底物溶液连续加到反应器中；反应前后PH会有较大变化的，必须在反应过程中进行调节。底物浓度底物浓度是决定酶催化速度的主要因素。要确定一个适宜的底物浓度范围。要防止高浓度底物的抑制作用酶浓度综合考虑反应速度和成本，确定一个适宜的酶浓度

43、。对连续式固定化酶反应器应具备添加或更换酶的装置，而且要求这些装置的结构简单、操作容易搅拌速度保证酶与底物混合均匀，使酶分子与底物分子能够进行有效碰撞，进而互相结合进行催化反应。首先要在试验的基础上确定适宜的搅拌速度，并根据情况的变化进行搅拌速度的调节。流动速度流化床反应器，通过控制进液口的流体流速和流量以及进液管的方向和排布等方法，加以调节。填充床式反应器，必须选择好适宜流速。膜反应器，采用适当的速度搅拌，使粘附在膜表面的固形物和大分子物质离开膜表面，还可以通过控制流动速度和流动状态，使反应液混合均匀，减少浓差极化现象的发生。喷射式反应器，可以控制蒸汽压力和喷射速度进行调节6.操作的注意事项：1) 保持酶反应器的操作稳定性2) 保持反应器中流体的流动方式和状态3) 防止酶的变性失活4) 防止微生物污染7.二代酶反应器： 含辅因子的酶反应器：辅因子价格昂贵，需再生循环使用才能降低成本，因而发展了辅因子再生酶反应器 多相或两相反应器：使酶反应在有机相中进行，可增加反应物浓度，还可减少底物，特别使产物对酶的抑制作用 固定化多酶反应器：将多种酶固定化后，制成多酶反应器，模拟微生物细胞的多酶系统，进行多种酶的顺序反应，来合成各种产物