实验一凝胶过滤层析分离蛋白质.ppt

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1、生物化学与分子生物学实验,带教: 张学礼、戴薇薇 龚张斌、黎志萍,实验课要求 试剂用后及时归位 及时记录实验结果 按时完成实验报告 离开时做好清洁工作,实验报告的书写,标题日期 一、实验目的 二、实验原理 三、操作步骤 四、实验结果 五、分析讨论,实验基本操作,一、玻璃仪器的洗涤 二、吸量管及微量取样器的使用 三、溶液的混匀 四、离心机的使用,实验一 凝胶过滤层析法分离蛋白质,1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。,一、 实验目的,二、 实验原理,1. 常用生化实验技术,分光光度技术 电泳技术 离心技术 层析技术,2. 层析技术（色谱技术）,是利用混合物中

2、各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 和力等）建立起来的技术。,（1）层析系统的基本组成,固定相 + 流动相,固体物质 / 固定于固体物质的成分,可以流动的物质：如水和各种溶媒,待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相,由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比）不同,与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快,（2）层析法的分类,按两相所处状态分类,按层析原理分类,按操作形式不同分类,（3）层析技术的优点,分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广,适用： 杂

3、质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析,3. 凝胶过滤层析法（gel filtration chromatography）,（1）原理： 根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗 粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部， 大分子物质被排阻在外。,又名分子筛过滤，排阻层析,（2）凝胶的特点,属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要 有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。,交联葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶,（3）凝胶的选择,葡聚糖凝胶 (商品名: Sephadex，Dextran) 型号: G-10 G-200,多孔

4、网孔结构,数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小,Sephadex G-50： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 1500 30000 Sephadex G-200： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 5000 80000,例：,B. 琼脂糖凝胶 ( 商品名: Sepharose , Bio- gel A ) 对实验条件要求高 ( 温度, pH ) 40 4.5- 9.0 工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限, 用于大分子物质的分离,C. 聚丙烯酰胺凝胶 商品名: Bio gel P（生物胶P）,三、实验操作,1. 柱的选择 直径： 15 cm 一般长度：直径 = 10：1 2

5、0：1 本实验玻柱： 直径0.8 1.5cm 长度 17 20cm,2. 凝胶选择、制备,血红蛋白 溶菌酶 分离 （64500） （11400） 选择 Sephadex G-50,Sephadex G-50： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 1500 30000,制备： 将干胶颗粒悬浮于5 10倍的蒸馏水或洗脱液中 充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去,3. 凝胶装柱,柱固定于架子上，垂直放置，关住出口 自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉， 至1 2cm时，打开出口 凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口,注意点：,垂直放置 防止气泡产生 防止柱的分层,4. 平衡

6、,放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实）,注意：,防止床面干涸，可适当补充蒸馏水,5. 加样, 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露 出床面时，立即关闭出口（将干未干） 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, 立即加入12倍于样品体积的蒸馏水,6. 洗脱,当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸 馏水，进行洗脱，直到两带分开 检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后， 用试管分步收集洗脱液 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）,缩二脲反应 （双缩脲反应）,肽键,四、实验结果,绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果,下次实验： 碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定 时间：4月18日上午9：00开始,五、讨论,