实验四微生物的菌落形态观察平板菌落计数及菌种保藏(张理珉).ppt

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1、实 验 四微生物的菌落形态观察、平板菌落计数及菌种保藏,目的要求,1、观察细菌、放线菌、霉菌的菌落形态特征，并加以区分。 2、掌握平板菌落计数的原则和方法。 3、掌握三种类群微生物的单菌落挑取，并接种于斜面，进一步加强无菌操作技术。 4、了解菌种保藏的原理、重要性及常见方法。,实验内容,微生物菌落形态观察及区分（细菌、放线菌、霉菌、酵母菌放在后面介绍） 平板菌落计数（细菌、放线菌、霉菌） 挑取单菌落接种于斜面 介绍菌种保藏的原理和方法,对于一个样品，针对微生物来说最想了解的问题（首要问题）,存在的微生物种类 各类微生物的数量 各类微生物的作用 说明： 只是针对可人工培养的微生物来说，乐观估计可

2、人工培养的部分只占总数的10%（保守估计只有1%）； 证据来源有两方面分子生物学的探索；和原位培养的比较。,实 验 内 容 一微生物菌落形态观察及区分,一、微生物的形态和菌落特征的比较表,二、细菌菌落形态的多样性（示意图）,延展性较强的一些霉菌菌丝（松散）,平板中菌落形态,三、菌落特征描写方法,大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。 颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。 干湿情况 干燥、湿润、粘稠 形态 圆形、不规则等 高度 扁平、隆起、凹下 透明程度 透明、半透明、不透明 边缘 整齐、不整齐 注意：可以进

3、一步细分描述,菌落形态可因培养基成分不同而发生显著变化（枯草芽孢杆菌在营养缺乏时形成的雪花状菌落）,四、各类型菌落的总体特征反映细胞结构及特点,细菌含水量高（多，形成毛细管水），湿润，细腻（个体小）。 细菌菌落说明：光滑型一般具有荚膜；表面粗糙、褶皱、折光性强（不透明）菌落一般具有芽孢；菌落大而扁平一般具有鞭毛。 放线菌菌落大小差别不大，相对较小，干燥（粉状），菌丝细（肉眼分不清楚）。 霉菌菌落较大，干燥（粉状，较粗，颗粒），丝状较粗（肉眼可以区分）。 以最少的特征指标完成区分或分类最好。,细菌的培养特征,包括（群体形态特征）： 各种固体培养基上的形态（针对菌落） 各种液体培养基上的表现形态

4、各种斜面培养基上的表现形态（针对菌苔） 各种半固体培养基上的形态（穿刺培养） 其它 注意：微生物菌落形态的区分除了通过肉眼进行区分判断外，还可以借助其它工具进行直接接触区分判断（牙签、接种工具等）,细菌菌落扫描电镜显微照片,实 验 内 容 二从分离平板上挑取单菌落,挑取细菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上接种环 挑取放线菌单菌落接种于高氏1号培养基斜面上接种环、接种钩 挑取霉菌单菌落接种于马丁氏培养基斜面上接种环、接种钩,一般流程图（无菌操作）： 拿起平板并打开用接种工具挑取单菌落放于酒精灯外焰旁（不得过近？）放下平板拿起斜面并取下塞子用已粘有菌体的接种工具在斜面上划“之”字线或直线接种工

5、具取出、灼烧塞好胶塞作标记（菌种名称、接种人、接种日期等）。,接种斜面的演示图,操作要点： 始终保持无菌操作； 棉塞或硅胶塞不放于桌面，只能夹于拿接种工具的手中（小手指和手掌中间或无名指和小手指中间）； 一般在斜面培养基上以“之”线划接种（充分利用斜面，得到最大量的菌体）； 有时也进行直线接种划线（斜面培养特征观察）,说明：,注意试管斜面的拿法（手掌向上，斜面向上），与接种工具的配合使用； 记号笔标记时，过火烤一下，字不容易掉； 挑取单菌落于相应斜面，管口标记学号，橡皮筋捆扎（三支）； 三支斜面的接种情况作为一次考核，记入平时成绩。,实 验 内 容 三平板菌落计数,一、相关知识介绍,1、微生物

6、增殖和样品微生物数量的计量平板菌落计数 使单细胞形成菌落，一个单菌落代表一个单细胞，从而反映出微生物的数量。 （1）利用计数器在显微镜下直接计数（以后介绍）； （2）最大或然数（Most probable number，MPN，又称稀释培养测数法、最大可能数）； 适用具有特殊生理功能的类群存在但不能人工培养形成单菌落，可以利用生化手段检测出；利用统计学原理计算，结果粗放，只能得到数量级（近似数）。,（3）菌体浊度的测定（只针对单细胞微生物）； 利用分光光度计在600nm测定吸光度值。 （4）细胞干重和湿重的测定（有时湿重以体积计量）； （5）各种细胞物质含量的测定（蛋白质、核酸、 ATP、磷、

7、叶绿素等定量测定）建立了多种快速检测方法； 说明：后两种对丝状菌比较有意义。,2、常见微生物检测项目,（1）常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数 （2）致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O-157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等,3、快速检测方法的现状,国外许多政府检测机构都在大量使用快速检测方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和显色培养基法在国外应用相当成功。 国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正在考虑使用国外先进的快速检测技术。 从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测的一大方向（？）。,4、常规微生物快

8、速检测技术现状,传统计数改良法： （1）螺旋平板计数法：螺旋接种仪菌落计数仪 （2）滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测。 （3）纸片法：培养基固体在载体上。省去制做培养基的时间。主要用于细菌总数检测。 （4）其它：如Simplate即用胶，改良MPN产品。,螺旋平板法,DWS螺旋平板接种仪,aColyte自动菌落计数仪,螺旋平板原理,平皿旋转,接种针往外移动同时自动将样品稀释1000倍。,快速检测微生物数量的新方法： （1）ATP法 （2）电化学法 （3）颜色变化 （4）流式细胞技术及激光扫描技术 （5）其它：热量法，放射测量法 说明：检测方法建立的基础可测、稳定、重现、可行、简便,浊度与微生

9、物生物量测定,原理： 细胞的存在会造成光的散射，降低光线的透过； 在一定范围内细胞浓度与吸光度成正比,二、平板菌落计数的优缺点,优点：反映的是微生物活菌数量，可获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。 缺点：操作较繁，所需时间较长，测定结果易受多种因素的影响。,三、平板菌落计数的表述及计算,因为微生物不易完全分散成单个细胞； 菌落的来源也并非完全为单个细胞； 因此其测定结果比实际菌数偏低； 引入菌落形成单位（colony-forming units，cfu）来表示，而不以绝对菌体数量来表示样品的活菌含量。 计算公式

10、：,计算公式说明： 如样品来源为液体其表示为CFU/ml； 所加样品量为每个平板所加入的相应稀释液的体积（ml）。,四、菌落计数原则（六条）,1、先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。,2、首先选择平均菌落数在30300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的细菌总数（见下表，例1）。 3、若有两个稀释度的平均菌落

11、数均在30300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中稀释度(倍数)较小的计算菌落总数（见下表，例2及例3）。,4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例4）。 5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例5）。 6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例6）。,计算菌落总数方法举例（加样量为1mL）,针对计数原则的说明,1、比较时要换算至同一个稀释度进行； 2、霉

12、菌可能难以完全遵循此六项计数原则，菌落大，漫延性强，30300个/皿时，菌落过密重叠而无法计数。 3、牛肉膏培养基： 只计细菌的数量 高氏1号培养基：只计放线菌的数量 马丁氏培养基： 只计霉菌的数量,五、平板菌落计数结果的统计表,实 验 内 容 四介绍菌种保藏的原理和方法,一、菌种保藏的重要性,微生物基本特性所决定的微生物个体微小、代谢活跃、生长繁殖快、易变异、易污染。 研究工作的连续性需要。 工业及科研菌种要注意菌种的衰退和复壮。,二、菌种的衰退,菌种衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。,纯菌种,自发突变,突变个体,传

13、代增殖,原始个体,不纯菌种,衰退菌种,三、菌种衰退的现象,菌落和细胞形态改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少 代谢产物生产能力下降，即出现负突变 致病菌对宿主侵染能力下降 对外界不良条件的抵抗能力下降等,四、菌种衰退的原因,基因突变主要原因 1、有关基因发生负突变导致菌种衰退 2、表型延迟造成菌种衰退 3、质粒脱落导致菌种衰退 连续传代加速衰退 不适宜的培养和保藏条件加速衰退,五、菌种衰退的防止,控制传代次数 创造良好的培养条件 利用不易衰退的细胞移种传代 采用有效的菌种保藏方法 讲究菌种选育技术 定期进行分离纯化，测试性能,六、菌种的复壮,狭义的复壮消极的措施 是指在菌种已经发生衰退的情况下，

14、通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。 广义的复壮积极的措施 是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。,七、菌种复壮的主要方法,1、纯种分离法 通过纯种分离，可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状。,2、宿主体内复壮法 对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。 3、淘汰法 将衰退菌种进行一定的处理（如药物、低温、高温等），往往可以

15、起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。 4、遗传育种法 把退化的菌种重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。,八、菌种保藏达到的目的,1、存活，不丢失，不污染； 2、防止优良性状丢失； 3、随时为生产、科研提供优良菌种。,九、菌种保藏的基本原则,使微生物的新陈代谢处于最低或几乎停止的状态,十、常采取的措施,1、低温4、-20 、-70 、-196 2、干燥降低水活度（aw） 3、缺（绝）氧针对专性好氧菌 4、低营养状态 5、高渗透压防腐（针对食品等）,十一、常见的方法,传代培养法 一般斜面培养基4 保存 、在培养物表面覆盖无菌石蜡油（1cm以上） 悬液法（蒸馏水、缓冲液

16、） 对乳酸菌、酵母菌等有一定作用和效果 载体法（砂土、滤纸片等） 针对微生物所产的孢子保存较好，所以抗生素生产菌种常用 真空干燥法（冷冻真空干燥法、L-干燥法） 对不产孢子的丝状真菌营养体保存效果不好，不宜采用 冷冻法（-20、-70、-196，保护剂） 温度越低效果越好，液氮适用于所有生物材料的保存,保护剂的选择,作用可以使细胞经低温冷冻时减少冰晶的形成，从而避免冰晶的机械损伤（玻璃化）。 真空冷冻干燥法脱脂牛奶、多种糖类溶液、蛋白及多肽溶液等 冷冻法甘油溶液（1040%）；二甲亚砜、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等 脱脂牛奶的制备： 鲜牛奶煮沸冰箱静止过液吸取底部牛奶（虹吸） 鲜牛奶煮沸离心除脂

17、（表层乳脂）,几种常用菌种保藏方法的比较,十二、菌种保藏的补充说明,菌种保藏不是要求所有保存菌种都保持存活，而是在加入大量菌体经保藏处理后还有少量存活； 保藏可以采用多种措施联合共同完成。 针对专性寄生生物体还有一类宿主保藏法（下面介绍）,宿主保藏法（针对专性寄生生命体）,此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。 植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。 噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。 动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。,十三、国内外菌种保藏机构,国内外都有专门的保藏机构和制度 其任务广泛收集科研和生产

18、菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。 菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）,中国微生物菌种保藏机构名称和缩写,国际微生物菌种保藏机构名称和缩写,国际微生物菌种保藏机构名称和缩写,国家自然科技资源平台 微生物菌种常规保藏技术规程（试行）,思考题,1、在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落形态特征（共性特征）。P74(1-2) 2、结果：填95页表格（后面有一定修改的表格提供）。P95(1) 3、要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？P95(2-2) 4、根据你自己的实验，谈12种菌种保藏方法的利弊。P88(2-1) 注意：实验报告每一项和作业每题不超过100字 （五行文字），能以图表表述最好。,另外的思考题（不需要做，仅思考）,1、为什么采用斜面低温保藏法菌种较易发生衰退（相对于其他保藏法而言）？但为什么实际工作中还是较多地被采用？ 2、为什么说冷冻真空干燥保藏法与液氮超低温保藏法是目前两种比较理想的菌种保藏方法?,