间接免疫荧光(6页).doc
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1、-间接免疫荧光-第 6 页间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性1 材料和仪器293细胞大鼠抗LMP2单克隆抗体FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体荧光显微镜2 检测方法2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.52.0105个细胞/孔,37,5% CO2培养箱培养过夜,细胞生长成片。2.2 每个细胞孔感染2.0106VP供试品重组腺病毒,同时设置293细胞阴性对照孔。37,5% CO2培养箱培养两天,细胞完全病变。2.3 收集 293细胞。用PBS洗涤两次,重悬到100lPBS缓冲液中,每孔10l涂于细胞片上,室温自然晾干。2.4 将细胞片置于4丙酮中固定15分钟,PBS
2、洗两次,室温晾干。2.5 PBS浸泡10min,用PBS(含0.05%Triton-X100)浸泡通透25min。2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。2.6 细胞孔使用1:20 PBS稀释抗体,置于湿盒中,37孵育1小时。PBS洗89遍,保持湿润。2.7 覆盖1:40稀释的FITC标记(PBS稀释)的羊抗大鼠IgG,置于湿盒中,37孵育30分钟。PBS洗89遍,室温晾干。(如用PBS有颗粒沉淀)2.8 伊文氏蓝负染5分钟。超纯H2O洗3遍,室温晾干。2.9 50%甘油封片。2.10 显微镜下观察照相。3 结果判定显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色,供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光,即判
3、定为阳性。检测结果应为阳性。注:1、每一步均需晾干,细胞浓度可以比较高。2、水洗效果要好,无盐粒子颗粒。3、丙酮固定过夜效果较好。PBS稀释。当然最好用封闭液直接稀释,再加一点TritonX100效果好。培养液成分太多了。而且固定之后细胞都死了,用培养液没什么意义,只要保证其pH等条件适合就好了。抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。上网查一下,有很多protocol。一般一比几百到一万都有,依抗体而定。可以4度过夜,这样染色效果好。二抗一般较便宜,一般1:50到1:200多。Jdzhangwenjun5251. 直接免疫荧光法测抗原(1)基本原理将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其
4、优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。(2)试剂与仪器l 磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4l 荧光标记的抗体溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释l 缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制l 搪瓷桶三只(内有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)l 有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)l 荧光显微镜l 玻片架l 滤纸l 37温箱等。(3)实验步骤 滴加0.01
5、mol/L,pH7.4的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间(参考:30min)。 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗后,再按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不时振荡。 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:(-)无荧光;()极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(+)荧光明亮;(+ +)荧光闪亮。待
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