流式细胞分析的基本知识和应用.pdf

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1、流式细胞仪分析技术及应用 黄赞 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细 胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个 细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新 技术。 参考书： 流式细胞术，陈朱 波，曹雪涛，科学出版社 2010年 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞 器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过 荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对 细胞进行定量分析或纯化分选。 细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量、多参数、 高纯度分选 流式细胞术的特点 区别?区别?流式细胞仪?流式细胞仪?显微镜?显微镜? 光源?光源?激光?激光?自然光自然光、灯光灯光

2、、激光?激光? 对象?对象?细胞细胞、生物粒子?生物粒子?细胞细胞、组织等?组织等? 承载工具?承载工具?鞘液及流动室?鞘液及流动室?载玻片?载玻片? 检测信号?检测信号?光学信号?光学信号?形态及染色?形态及染色? 放大方式?放大方式?PMTPMT、放大电路?放大电路?目镜目镜物镜物镜、光学放大?光学放大? 统计?统计?计算机计算机，5000?5000?人工人工，200?200? 结果?结果?多参数多参数，综合分析?综合分析?简单简单，少数参数?少数参数? 流式细胞仪与显微镜的区别 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强 度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分 选基础上发展起来的对细胞的物理或化

3、学 性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、 蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类 收集的高技术。 第一节 概述 流式细胞术发展史 1930 年，Caspersson 和Thorell 开始致力于细胞的计 数。 1934 年，Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动 化的人，他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞。 1936 年，Caspersson 等引入显微光度术。 1940 年，Coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细 胞内的特定蛋白。 1947 年，Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计 数器。 发展史 1949 年，Wallace Coulter 提出在悬液中计

4、数粒子的方法 的专利。 1950 年，Caspersson 用显微分光光度计的方法在UV 和 可见光光谱区检测细胞。 1953 年，Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功的 设计红细胞光学自动计数器。同年，Parker 和Horst 描 述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形。 发展史 1954 年，Beirne 和Hutcheon 发明光电粒子计数器 1959 年，B 型Coulter 计数器 1965 年，Kamemtsky 等提出两个设想，一是用分光光 度计定量细胞成分；二是结合测量值对细胞分类。 1967 年，Kamentsky 和Melamed 在Molda

5、ven 的方法的 基础上提出细胞分选的方法。 发展史 1969 年，Van Dilla，Fulwyler 及其同事们在Los Alamos，NM（即现在的National Flow Cytometry Resource Labs）发明第一台荧光检测细胞计。 1972 年，Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型， 能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光 信号。 1975 年，Kohler 和Milstein 提出了单克隆抗体技术，为 细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础。 发展史 1973 年，BD 公司与美国斯坦福大学合作，研 制开发并生产了世界第一台商用流式细

6、胞仪 FACS I。 从此，大量的厂家不断研制生产出自己的流式 细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞速发展 的时 细胞组成 细胞功能 大小 细胞表面/胞浆/核-特异性抗原 粒度 细胞活性细胞周期、凋亡 DNA, RNA含量 胞内细胞因子 蛋白质含量 激素结合位点 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性 蛋白修饰 流式细胞仪常检测的细胞特性 采用激光作为激发光源，好的单色性与激发效率； 荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，灵敏 度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多 个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统 计分析精确性。 一、工作原理 待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性

7、荧光染 料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进 入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交， 细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产 生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号， 同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转 换为电子信号输入电子信息接收器、通过计算 机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多 参数分析，从而实现了细胞的定量分析。 单细胞液柱? 已标记的单细 胞悬液和鞘液? 硅化管? 流动室?喷嘴? 荧光检测系统和? 散射光感受系统? 收集光信号? 荧光染料被 激发发光? 光电倍增管? 脉冲信号? 计算机系统 分析结果? 放大? 垂直相交? 形成稳态?水平激光与之? 基本过程 基本工作

8、原理 主要技术指标 测量灵敏度：单个微球上最少标有FITC 或PE荧光分子数目表示 分辨率：通常以变异系数CV表示 前向角散射光检测灵敏度：0.20.5微米 分析速度：每秒可分析的细胞数 （1）液流系统液流系统: :依次传送待测样本中的依次传送待测样本中的 细胞到激光照射区细胞到激光照射区。 ? （2 2）光学系统光学系统: :细胞由激光激发,通过光学 滤片产生光信号,并传送到相应的探测器 ? （3 3）数据处理系统数据处理系统: :把光信号转换为电信号 ? 1.流式细胞仪的基本结构： 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单 抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动

9、室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心 位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 （1）液流系统 喷嘴 Fluorescence 鞘液 液流系统示意图 FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流） 样本管 鞘液管 增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。换 言之，在特定时间内，允许更多细胞通过液流。当液柱变宽时， 一些流经激光束的细胞会偏离中心，光斑也会偏离理想角度，这 在一定程度下是允许的。 高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间距离缩高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间距离缩 短，这样在单位时间

10、内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速 获取数据。?获取数据。? 低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞 可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流 速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA 分析。?速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA 分析。? 为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对实验操作为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对实验操作 是至关重要的。?是

11、至关重要的。? 激光光源：488nm气冷式氩离子激光 器 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 分色反光镜：反射短波长，通过长波 长 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 （2）光学系统 Flow Tip Laser SS and FL Detector FS Detector 光学系统示意图 二向色性长通滤片(DICHROIC FILTER) 一定波长以上的光通过，该波长以下的光被折 射。45 度角放置度角放置 带通滤片(BAND PASS) 允许一定波长的光通过 主要由计算机及其软件组成 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光） （3

12、）数据处理系统 信号放大方式 经过PMT 将光学信号转变为电脉冲信 号，并增加PMT 的电压及增益，可将 脉冲信号进行放大。放大方式有两种： 通常前散射信号用线性放大，荧光信号用对数放大 细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分 为前向散射光和侧向散射光。 二、散射光的测定 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以 相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等 粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 FALS Sensor Laser 前向散射光示意图

13、选取FSC 作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒， 以避免对被测细胞的干扰。 侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部结构 属性。 FALS Sensor 9090LS Sensor Laser 侧向散射光示意图 侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关 细胞内精细结构和颗粒性质的信息 测得的FS与SS信号 通过计算机处理， 可得到FS-SS图， 由此可仅用散射光 信号对未染色的活 细胞进行分析或分 选。此为血细胞分 类的基本原理，但 不能分析表面分子。 光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些

14、亚群 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。 线性放大器和对数放大器 三、荧光测量 荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生 两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出 微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经 过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光 信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析就能 了解所研究细胞参数的存在与定量。 荧光染料的

15、特性 激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION) 荧光补偿 荧光补偿是用电子的方法校正荧光染料光谱之 间叠加所造成的误差，在完成双色以上的免疫 荧光分析时都需要作颜色补偿。 一种荧光染料不只发出一个波长，而是一定范围 的波长。只是其中一部分较其他染料“亮”。 带通滤片接收的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光 同时被接收，然后一同进入PMT 进行光电转换并放大。 FL2(575BP)在接收RD1 的同时，亦接收了一部分FITC(干 扰)。这部分干扰占FITC 总量的X%。故真正的FL2=实测 RD1(FL2)-干扰的FITC(FL1)。即通常所说的：FL2-X %FL1 通过流式

16、细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。 四、细胞分选原理 细胞悬液形成液流柱 流动室振动 液流断裂成液滴 空白液滴 含细胞的液滴 弃去 偏转落入收集器 压电晶体 产生机械振动 不充电 充电 （一）分选基本原理 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬 液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞 的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过 测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细 胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。 （二）分选的技术要求 参数：FS,S

17、S,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双 参数散点图 、二维等高图 、假三维 等高图 、三参数散点图 ） 设门分析技术 第二节 数据的显示与分析 FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少 一、 参数 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 直分析方图 设门分析:REGION和GATE设置 二、数据显示方式 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。 （一）单参数直方图 单参数直方图 细 胞 相 对 数 量 信道 (channel ) 统

18、计直方图统计区间 的无限缩小 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测 量细胞的两个测量参数，根据这两个参数 就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的 是点密图，在图中，每个点代表一个细胞， 点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。 （二）双参数直方图 1.双参数直方图点图 绿色荧光强度 红 色 荧 光 强 度 2. 二维等高图 由类似地图上的等高线组成，其本质也是 双参数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细 胞相对或绝对数，即“等高”。 反应细胞群的集中点 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞 数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化

19、率越大。 二维等高图 （三）三参数直方图 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信 号可根据需要进行组合分析。 （四）流式细胞仪的多参数分析 Gate设置：指在某一张选定参数的直 方图上，根据该图的细胞群分布选定 其中想要分析的特定细胞群，并要求 该样本所有其他参数组合的直方图只 体现这群细胞的分布情况。 三、设门分析技术 根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多边形门、任意形状门和十字门。 线性门 矩形门 Control shGATA2 十字门 A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞 A、B、C均 为任意门 任意门 门 通过设门的方法可以定义细

20、胞亚群的区域。如： 血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细 胞，可根据FSC 或细胞大小，在FSC，SSC 的散 点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的 荧光特性。 细胞的群体性 样本制备 标记染色 液相芯片技术 质量控制 第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞 培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤 单细胞悬液 一、免疫检测样品制备 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）

21、适用条件: 有较高的量子产额和消光系数 对488nm的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 二、常用的荧光染料与标记染色 FITC Texas red PE.PC.APC PEcy5 FL1 FL2 FL3 FL4 激光 细 胞 悬 液 异硫氰酸荧光素 得州红 能量传递复合染料 藻胆蛋白类 （一）几种常见的荧光染料 名称 染料 激发 波长 荧光颜色 溶解性 对PH敏 感性 特点 异硫氰酸荧光素* FITC 488 绿 525 易 敏感 易溶于水，与抗体结 合不影响特异性 CSFE 488 517 藻红蛋白* PE 488 橙 57

22、5 易 不敏感 具较多发光基团，消 光系数和量子产额高 别藻青蛋白 APC 633 红 670 能量传递复合染 料* PEcy5 488 红 670 易 不敏感 减少交叉，成本高 PE- CY7 488 755 * 7-ADD 488 675 * PI 488 620 PerCP 488 675 常用的几类荧光染料 用化学法将两种不同激发波长的染料结合 在一起，在488nm激发光照射下，通过一 个荧光染料被激发后产生的发射波长再激 发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测 到该特定荧光信号。 能量传递复合染料 PE CY5 CY5 CY5 488nm 575nm 670nm 红色荧光 花青苷5 藻

23、红蛋白 能量传递复合染料机制 荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合(DNA) 共价键结合(CSFE) 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记 （二）免疫荧光标记 适当的制备方式 处理红细胞 实体组织来源标本用机械法 温度2537，pH7.07.2 三、流式细胞免疫学技术的质量控制 （一）单细胞悬液制备的质控 温度 pH 染料浓度（滴定） 固定剂 （二）免疫荧光染色的质控 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流 处于正交状态，减少变异（CV）。 PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检 测时仪器处

24、于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。 （三）仪器操作的质控 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照， 选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和 设置电压，以保证特异性。? 封闭抗体FcFc受体4G104G10，降低背景 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测， 结果达靶值，提示本次实验结果可靠。 （四）免疫检测的质控 阴性对照 阳性对照 检测抗体的有效性 使用新抗体 换用新抗体 储存时间过长 使用肯定阳性的样品 使用两种不同标记的抗体 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和 逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表 面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特 性

25、，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。 第四节 在生物医学研究中的应用 表面分子标记 分化 干细胞 细胞分群 细胞增殖细胞周期 CSFE PI/DAPI BrdU Pyronin Ki67 BD区分双连体技术 荧光信号的面积和宽度: 采用对荧光光通量进行积分测量，一般对 DNA 倍体测量时采用面积（如FL2-A），这是因为荧光脉冲的面积 比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA 的含量，当形状差异较大，而 DNA 含量相等的二个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的，经过对 荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。 宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极容易 聚集，当两个G1 期细

26、胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号 （FL2-A）与G2 期细胞相等，这样得到的测量数据G2 期细胞比例 会增高，影响测量准确性。 Beckman技术：积分信号与峰值信号 4N 与2X2N 的积分信号相同，但峰值信号不同，由此可区分粘 连细胞。 方案的建立 参数选择：FS、SS、FL3(LIN)、 AUX(FL3 PEAK) 或加上RATIO(FL3 PEAK/FL3 LIN) 建立直方图： 利用RATIO 参数 利用FL3和FL3PEAK CSFE染色 BrdU染色和PI染色的区别 Control PSTPIP2 干细胞：细胞周期与静息 细胞内染色 磷酸化 DNA/RNA 细胞因子 DNA多倍体 磷酸化cyclin E