免疫标记技术节酶免疫技术.ppt

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1、免疫标记技术节酶免疫技术现在学习的是第1页，共54页第十六章第十六章 酶免疫技术酶免疫技术 现在学习的是第2页，共54页1.1.酶联免疫吸附试验的原理、方法类型、酶联免疫吸附试验的原理、方法类型、 应用及注意事项。应用及注意事项。2.2.酶免疫分析技术的分类。酶免疫分析技术的分类。3.3.常用的酶及酶的底物。常用的酶及酶的底物。4.4.其他酶免疫技术的基本原理及应用。其他酶免疫技术的基本原理及应用。本章要点现在学习的是第3页，共54页目录目录 酶标酶标志志物的制备物的制备 1 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 2其他酶免疫技术其他酶免疫技术 3现在学习的是第4页，共54页前前 言言 酶免疫分析

2、技术是以酶标记抗原或抗体为主要试剂，酶免疫分析技术是以酶标记抗原或抗体为主要试剂，检测样本中相应的抗体或抗原。检测样本中相应的抗体或抗原。 将抗原抗体反应的将抗原抗体反应的特异性特异性和酶催化底物的放大作用和酶催化底物的放大作用和和高敏感性高敏感性相结合的一种免疫检测技术。相结合的一种免疫检测技术。现在学习的是第5页，共54页酶酶免免疫疫技技术术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均均 相相非均相非均相固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定现在学习的是第6页，共54页第一节第一节 酶标志物的制备酶标志物的制备 一一 、常用的酶和底物、常用的酶和底物标记酶的条件：标记酶的条

3、件： 1.1.活性高，纯度高活性高，纯度高2.2.作用专一性强作用专一性强3.3.性质稳定，易与抗原或抗体偶联性质稳定，易与抗原或抗体偶联4.4.测定方法简便易行、敏感、精确测定方法简便易行、敏感、精确5.5.酶和底物对人体无害且价廉易得酶和底物对人体无害且价廉易得现在学习的是第7页，共54页1.1.辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP） 糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心辅基是酶的活性中心RZRZ值越大纯度越高值越大纯度越高RZRZ值与酶活性无关，酶值与酶活性无关，酶活性单位比活性单位比RZRZ值更为重

4、值更为重要要 ELISAELISA中应用最为广泛中应用最为广泛的标记用酶的标记用酶 常用酶常用酶现在学习的是第8页，共54页HRPHRP的底物的底物 DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2H D+2H2 2O O HRPHRP供氢体供氢体DHDH2 2习惯上被称为底物，底物有多种。习惯上被称为底物，底物有多种。H H2 2O O2 2为受氢体，不稳定，需在用前临时配置。为受氢体，不稳定，需在用前临时配置。现在学习的是第9页，共54页OPDOPD反应后显橙黄色，反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长黄色，测定波长492nm492nm。不稳定，致癌性。不稳定，

5、致癌性。TMBTMB反应后显蓝色反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为加酸终止反应后变为黄色黄色, ,测定波长测定波长450nm 450nm ，稳定，无致癌性，稳定，无致癌性，ELISAELISA中应用最广泛的中应用最广泛的底物。底物。 HRPHRP的常见底物的常见底物 现在学习的是第10页，共54页2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶 是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌中提取是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌中提取 。ALP 底物底物 对对- -硝基苯磷酸酯（硝基苯磷酸酯（ pNPP ）经经APAP作用后的产物为黄色对硝基作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为酚，最大吸收峰波长为405405nm。 现在学习的

6、是第11页，共54页二二、制备酶标记抗体制备酶标记抗体( (抗原）的方法抗原）的方法制备酶标记物的方法应符合简单、产量高，避免酶、制备酶标记物的方法应符合简单、产量高，避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物，标记反应抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物，标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。 主要方法：戊二醛交联法主要方法：戊二醛交联法 改良过碘酸钠法改良过碘酸钠法 现在学习的是第12页，共54页三、酶标记物的纯化与鉴定三、酶标记物的纯化与鉴定纯化纯化的方法较多，分离大分子的方法较多，分离大分子混合物混合物的方法均可应用的方法均可

7、应用。常用的是凝胶层析法和常用的是凝胶层析法和硫酸铵硫酸铵盐析法，盐析法，硫酸铵硫酸铵盐析盐析法法操作简便操作简便。 酶标记物的酶标记物的鉴定鉴定主要主要有：有：1 1、酶活性和抗体（抗原）免疫活性的鉴定酶活性和抗体（抗原）免疫活性的鉴定 2 2、酶标记率的测定酶标记率的测定 现在学习的是第13页，共54页四四、固相载体、固相载体 （一）固相载体的要求（一）固相载体的要求结合抗体或抗原的容量大；结合抗体或抗原的容量大；与抗原或抗体结合稳定且不易脱落；与抗原或抗体结合稳定且不易脱落；不影响所固定的抗体或抗原的活性；不影响所固定的抗体或抗原的活性；固化方法应简便、快速。固化方法应简便、快速。 现在

8、学习的是第14页，共54页（二）固相载体的种类（二）固相载体的种类1 1塑料制品塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状 主要有微量反应板、小试管和小珠三种。主要有微量反应板、小试管和小珠三种。 2 2微粒微粒 微颗粒是由高分子单体聚合成的微球微颗粒是由高分子单体聚合成的微球 或颗粒。或颗粒。 3.3. 膜载体膜载体 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸 纤维素膜（纤维素膜（NCNC）、玻璃纤维素膜等。）、玻璃纤维素膜等。 现在学习的是第15页，共54页第二节第二节 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验一、一、ELISAELISA的检测原理

9、的检测原理 将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法将固相上的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开。加入酶的底物后，通过复合物与液相中的游离成分分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显色反应程度，对标本中抗原或抗体进行酶对底物催化的显色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定量。定性或定量。现在学习的是第16页，共54页二、二、ELISAELISA的方法类型的方法类型（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，适用于检测双抗体夹心法

10、是检测抗原最常用的方法，适用于检测含有至少两个抗原决定簇的较大分子抗原的测定。含有至少两个抗原决定簇的较大分子抗原的测定。 现在学习的是第17页，共54页 E固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）酶标抗体酶标抗体EE底物底物现在学习的是第18页，共54页如果血清标本中含有类风湿因子（如果血清标本中含有类风湿因子（RFRF），则可出现），则可出现假阳性反应。因为类风湿因子是一种抗变性假阳性反应。因为类风湿因子是一种抗变性IgGIgG的自身的自身抗体，它可同时与固相抗体和酶标抗体的抗体，它可同时与固相抗体和酶标抗体的FcFc段发生段发生结合，导致假阳性的出现。结合，导致假阳性的出现。 现在学

11、习的是第19页，共54页（二）双位点一步法（二）双位点一步法测定抗原时，如应用针对抗原测定抗原时，如应用针对抗原分子分子上两个不同上两个不同抗原决定抗原决定簇簇的的单克隆抗体单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步一步。 现在学习的是第20页，共54页 EEE底物底物固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）酶标抗体酶标抗体现在学习的是第21页，共54页如果待检标本中抗原浓度过高，如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成容易形成“钩状效应钩状效应（hook effect

12、hook effect）”。钩状效应严重时，可出现。钩状效应严重时，可出现假阴性假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。现在学习的是第22页，共54页（三）间接法（三）间接法间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的的抗抗体抗抗体（亦（亦称称为酶标二抗）来检测已与固相结合的待为酶标二抗）来检测已与固相结合的待测抗体测抗体。现在学习的是第23页，共54页 固相抗原固相抗原标本（含抗体）标本（含抗体）酶标二抗酶标二抗底物底物EEE现在学习的是第24页，共54页此法由于受血清中高浓度非特异性

13、此法由于受血清中高浓度非特异性IgGIgG的干扰，通的干扰，通常要将待测标本进行一定稀释后才能测定。常要将待测标本进行一定稀释后才能测定。现在学习的是第25页，共54页（四）竞争法（四）竞争法竞争法竞争法既既可用于可用于检测检测抗原，抗原，也可用于也可用于检测检测抗体抗体 。现在学习的是第26页，共54页待测待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与合于固相的酶标抗原量与待测待测抗原的量呈反比抗原的量呈反比，待，待测抗原越多，其结合特异性抗体越多，而酶标抗测抗原越多，其结合特异性抗体越多，而酶标抗原与特异性抗体结合就减少，底物显色

14、反应浅；原与特异性抗体结合就减少，底物显色反应浅；显色越深，待测抗原量则越少。显色越深，待测抗原量则越少。 竞争法测抗原竞争法测抗原现在学习的是第27页，共54页酶标抗原酶标抗原 EEEE固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）底物底物E现在学习的是第28页，共54页竞争法主要用于检测小分子抗原，因小分子抗原只有竞争法主要用于检测小分子抗原，因小分子抗原只有一个抗原决定簇一个抗原决定簇 。现在学习的是第29页，共54页 竞争法检测抗体竞争法检测抗体HBcAbHBcAb和和HBeAbHBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。式有区别。现在学习的是

15、第30页，共54页1.1.竞争法检测竞争法检测HBcAbHBcAb：先将先将HBcAgHBcAg包被在固相载体上，形成固相抗原，之后加包被在固相载体上，形成固相抗原，之后加入待测样本和酶标的特异抗体，待测样本的抗体将与入待测样本和酶标的特异抗体，待测样本的抗体将与酶标抗体竞争与固相载体上的特异抗原结合，温育后酶标抗体竞争与固相载体上的特异抗原结合，温育后洗涤，加入酶底物显色，显色的强弱与洗涤，加入酶底物显色，显色的强弱与待测待测抗体的含量抗体的含量成反比成反比 。现在学习的是第31页，共54页固相抗原固相抗原标本（含抗体标本（含抗体）底物底物酶标抗体酶标抗体EEEEE竞争法检测竞争法检测HBc

16、AbHBcAb现在学习的是第32页，共54页2.2.竞争法检测竞争法检测HBeAbHBeAb：先将先将HBeAbHBeAb包被在固相载体上，形成固相抗体，同时包被在固相载体上，形成固相抗体，同时加入待测样本和中和抗原加入待测样本和中和抗原HBeAgHBeAg，待测样本的抗体将，待测样本的抗体将与固相抗体竞争与中和抗原与固相抗体竞争与中和抗原HBeAgHBeAg结合。加入酶标的结合。加入酶标的特异抗体特异抗体，再，再加入酶底物，则显色的强弱与待测样本中加入酶底物，则显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比的相应抗体的含量成反比。 现在学习的是第33页，共54页固相抗体固相抗体标本（含抗体）标

17、本（含抗体）抗原抗原酶标抗体酶标抗体EE底物底物E竞争法检测竞争法检测HBeAbHBeAb现在学习的是第34页，共54页 (五五) 捕获法捕获法固相载体上连接的是固相载体上连接的是IgMIgM的第二抗体的第二抗体，先将标本中的先将标本中的IgMIgM类抗体捕获，然后再分别加入特异抗原和酶标类抗体捕获，然后再分别加入特异抗原和酶标抗体（动物源性抗体（动物源性IgGIgG），形成抗人），形成抗人IgM-IgM-IgM-IgM-特异抗特异抗原原- -酶标抗体的复合物，复合物含量与待测酶标抗体的复合物，复合物含量与待测IgMIgM成正成正相关。最后加入底物，依据显色程度来确定待测血清相关。最后加入底物

18、，依据显色程度来确定待测血清中中IgMIgM的含量。的含量。 现在学习的是第35页，共54页固相抗人固相抗人lgMlgM抗体抗体E标本（含抗标本（含抗体）体）抗原抗原底物底物EE捕获法检测捕获法检测lgMlgM抗体抗体现在学习的是第36页，共54页在应用此法时需注意在应用此法时需注意RF(IgMRF(IgM类类) )及其他非特异及其他非特异IgMIgM的干的干扰。扰。RF(IgMRF(IgM类类) )既能与固相载体上的既能与固相载体上的IgMIgM第二抗体结合，第二抗体结合，又能与随后加入的酶标抗体结合又能与随后加入的酶标抗体结合，从而导致假阳性结果从而导致假阳性结果。现在学习的是第37页，共

19、54页( (六六) ) 双抗原夹心法双抗原夹心法将已知抗原包被在固相载体上，待测标本中的相应抗体将已知抗原包被在固相载体上，待测标本中的相应抗体可分别与固相抗原和酶标抗原结合，形成固相抗原可分别与固相抗原和酶标抗原结合，形成固相抗原- -抗抗体体- -酶标抗原的复合物，加入底物后依据显色程度来确定待酶标抗原的复合物，加入底物后依据显色程度来确定待测抗体的含量。测抗体的含量。 现在学习的是第38页，共54页E固相抗原固相抗原标本（含抗体标本（含抗体）酶标抗原酶标抗原底物底物EE现在学习的是第39页，共54页三、三、ELISAELISA的关键技术的关键技术（一）各种试剂的制备（一）各种试剂的制备1

20、 1抗原和抗体抗原和抗体2 2包被与封闭包被与封闭 包被包被(coating)(coating)是是将抗原或抗体固定在固相载体上的过程将抗原或抗体固定在固相载体上的过程。封闭封闭(blocking)(blocking)就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在，从而排斥在ELISAELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。其后的步骤中干扰物质的再吸附。 3 3酶标酶标结合物结合物的制备的制备 现在学习的是第40页，共54页（二）最适工作浓度的选择（二）最适工作浓度的选择各类血清抗原稀释度1：501：1001：2001：4001：800强阳性1.201.0

21、40.840.680.42弱阳性0.640.410.300.220.19阴 性0.230.130.080.060.05稀释液0.080.020.020.020. 04间接法测抗体中包被抗原最适工作浓度的选择间接法测抗体中包被抗原最适工作浓度的选择 现在学习的是第41页，共54页（三）（三）测定方法的标准化测定方法的标准化 1 1加样加样 应力求准确，并注意不可产生气泡。应力求准确，并注意不可产生气泡。2 2温育温育 注意反应的温度和时间应按规定的注意反应的温度和时间应按规定的 要求要求，整块反应板的温度应一致。，整块反应板的温度应一致。3 3洗涤洗涤 洗涤有手工洗涤和洗板机洗涤两种方洗涤有手工

22、洗涤和洗板机洗涤两种方法，若用洗板机法，若用洗板机洗涤洗涤要适当增加洗涤次数。要适当增加洗涤次数。 4 4显色显色 要控制好显色时间。要控制好显色时间。现在学习的是第42页，共54页四、四、评价与应用评价与应用 评价评价ELISAELISA的方法的方法具有高度的特异性和灵敏度具有高度的特异性和灵敏度，操作方便快速，操作方便快速，试剂稳定，对环境无试剂稳定，对环境无污染污染，仪器仪器、设备要求简单设备要求简单，实验结果实验结果既可以用肉眼观察作定性分析，也可以用酶标仪进行定性既可以用肉眼观察作定性分析，也可以用酶标仪进行定性、定量分析，、定量分析，已经成为临床免疫检验中的常用技术。已经成为临床免

23、疫检验中的常用技术。现在学习的是第43页，共54页 应用应用1.1.病原微生物测定病原微生物测定2.2.激素测定激素测定3.3.药物测定药物测定4.4.肿瘤标志物肿瘤标志物5.5.蛋白质测定蛋白质测定现在学习的是第44页，共54页第第三三节节 其他酶免疫技术其他酶免疫技术一、均相酶免疫技术一、均相酶免疫技术 （一）酶扩大免疫分析技术（一）酶扩大免疫分析技术 （二）克隆酶供体免疫分析（二）克隆酶供体免疫分析现在学习的是第45页，共54页酶扩大免疫分析技术酶扩大免疫分析技术示意图示意图现在学习的是第46页，共54页克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析示意图示意图现在学习的是第47页，共54页 液相

24、酶免疫技术是非均相酶免疫技术的方法类型液相酶免疫技术是非均相酶免疫技术的方法类型之一，因抗原抗体反应在液相中进行而得名。其之一，因抗原抗体反应在液相中进行而得名。其依据样品抗原加样顺序和温育反应时相不同可分依据样品抗原加样顺序和温育反应时相不同可分为平衡法和非平衡法两种类型。为平衡法和非平衡法两种类型。 二、液相酶免疫技术二、液相酶免疫技术现在学习的是第48页，共54页三、斑点酶免疫吸附试验三、斑点酶免疫吸附试验属于属于ELISAELISA的一种类型的一种类型，与前述的与前述的ELISAELISA有所不同的是用有所不同的是用吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜（吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜（N

25、CNC膜）代替了聚膜）代替了聚苯乙烯反应板来作为固相载体，酶作用底物后形成有苯乙烯反应板来作为固相载体，酶作用底物后形成有色的沉淀物，使色的沉淀物，使NCNC膜染色。膜染色。 现在学习的是第49页，共54页现在学习的是第50页，共54页四、斑点酶免疫渗滤试验四、斑点酶免疫渗滤试验是将是将NCNC膜封于塑料小盒中，先在塑料小盒膜封于塑料小盒中，先在塑料小盒NCNC膜中滴加膜中滴加已知抗体，干燥后封闭，再依次加入待测标本、酶标抗已知抗体，干燥后封闭，再依次加入待测标本、酶标抗体，最后加入底物，阳性时可体，最后加入底物，阳性时可在在膜上出现有色斑点。膜上出现有色斑点。 现在学习的是第51页，共54页

26、五、免疫印迹试验五、免疫印迹试验是一种将蛋白质电泳和酶免疫测定相结合的技术，综合是一种将蛋白质电泳和酶免疫测定相结合的技术，综合了凝胶电泳的高分辨力和抗原抗体检测的高特异性和高了凝胶电泳的高分辨力和抗原抗体检测的高特异性和高敏感性，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用敏感性，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。的方法。 现在学习的是第52页，共54页现在学习的是第53页，共54页（一）生物素和亲和素的特点（一）生物素和亲和素的特点1 1生物素生物素(biotin(biotin，B)B)六、六、 BAS-ELISABAS-ELISA 2 2亲和素亲和素(avidin(avidin，A)A) 3 3链霉亲和素链霉亲和素(streptavidin(streptavidin，SA)SA) 现在学习的是第54页，共54页