微生物的营养和培养基.ppt

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1、第五章 微生物的营养,本 章 内 容,第一节 微生物的化学组成和营养要求,第四节 培养基,第三节 营养物质进入细胞的方式,第二节 微生物的营养类型,营养是生命活动的起点，是必需的物质基础。微生物的营养过程为其生命活动提供了物质、能量、代谢调节物和必要的生理环境的保障。,营养(nutrition)：生物体从外部环境中摄取生命活动必需的物质和能量，以满足正常生长、繁殖和各种生理活动之所需。 广义地说，营养是微生物获得和利用营养物的过程，是微生物维持和延续其生命形式的一种基本生理过程。 营养物(nitrient)： 具有营养功能的物质和能量（指光能对微生物来说）,第一节微生物的营养要素,1 微生物菌

2、体的化学组成元素水平,主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙等,微量元素：锌、锰、氯、钼、硒、钴、铜等,占细胞干重的97%,2 微生物的营养要素,按照营养物质在菌体中的生理作用的不同，可以将它们分成六大类：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水,一 碳源,在微生物生长繁殖过程中，能为其提供碳素营养来源的物质称碳源。即，是用来构建菌体物质中或代谢产物中的碳素骨架的营养物质。,从微生物的整体来看，可利用的碳源物质的范围称碳源谱。,对大多数异养菌来说，其最适碳源是“C.H.O”型碳源，其中： 糖类最广泛、最经济 酸醇脂类次要 糖类中： 单糖双糖、多糖 己糖戊糖 葡萄糖、果糖半乳糖、甘露糖等 淀

3、粉纤维素、几丁质等 一般不把含蛋白质、氨基酸的牛肉膏、蛋白胨等原料降格做碳源使用。,目前在微生物发酵工业中所利用的碳源物质主要有单糖、蔗糖、淀粉、糖蜜、麸皮、米糠.,在微生物生长繁殖过程中，能为其提供氮素营养来源的物质称氮源。即，是用来满足菌体物质中或代谢产物中的氮素需要的营养物质。,2.2 氮源,氮源谱,有机氮 N.C.H.O,无机氮 N.H,N.O,NH3 铵盐（NH4+） 硝酸盐 N2,蛋白质 核酸 氨基酸 尿素,一般而言，能利用有机氮的也以利用无机氮但是，能利用无机氮的不一定能利用有机氮。,对大多数异养菌来说，其最适氮源是“N.C.H.O”型或“N.C.H.O.X” 型氮源(有机氮源)

4、，“N.H”型氮源(无机氮源，如NH4+)次之。 在论及微生物培养基成分时，最常用的有机氮源是牛肉膏、蛋白胨、酵母膏及饼粕粉（黄豆饼、花生麸）蚕蛹粉、鱼粉等,按对氨基酸的需要的不同，可将微生物生物分为：,氨基酸自养型生物：不需要氨基酸做氮源，能利用尿素、铵盐、硝酸盐甚至氮气等自行合成所需氨基酸的生物,氨基酸异养型生物：需要从外界吸收现成的氨基酸做氮源才能满足需要的,三 能源,能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物 或辐射能，称能源。,能源谱,化学物质,辐射能,化能异养微生物的能源,有机物,无机物,化能自养微生物的能源,光能自养和光能异养微生物的能源,单功能营养物：如光能 多功能营养物：如

5、铵盐、氨基酸等,四 生长因子,微生物生长所必需的、但其自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的、需要量很小的有机化合物.,微 生 物 生长因子 需要量（ /ml） III型肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）胆碱 6 ug 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）硫胺素 0.5ng 白喉棒杆菌（Cornebacterium diphtherriae）B-丙氨酸 1.5ug 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）尿嘧啶 0-4ug 肠膜状串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）吡哆醛 0.025ug,广义的

6、生长因子 维生素、生物碱、卟啉、甾醇、短链的分支或直链脂肪酸、氨基酸等 狭义的生长因子仅指维生素 生长因子自养型微生物：多数真菌、放线菌和不少细菌 生长因子异养型微生物：乳酸菌、营养缺陷型突变株及致病菌等 生长因子过量合成的微生物：可用其生产有关的生长因子（如维生素），如阿舒假囊酵母生产B2，谢氏丙杆菌、有些链霉菌生产B12等。 配制培养基时，常使用生长因子丰富的天然物质制备物作为补充生长因子的培养基成分。 如：酵母膏、玉米浆、麦芽汁、肝浸液等。,五 无机盐,参与微生物中氨基酸和酶的组成；,调节微生物的原生质胶体状态，维持细胞的渗透与平衡,酶的激活剂,除C、H、O外的元素，有时又称无机盐，其基

7、本作用：,根据微生物对矿质元素需要量的大小，可分为：,微量元素指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素，需要量通常在10-6-10-8mol/L，如：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。,大量元素：Na、K、Mg、Ca、S、P等。,配制培养基时，大量元素一般首选K2HPO4、MgSO4等，可同时提供4种大量元素。 常用天然水、自来水来配制培养基以提供各种微量元素.,六 水,生理功能主要有：,起到溶剂与运输介质的作用； 参与细胞内一系列化学反应； 维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象； 高比热、高汽化热等，以保证微生物的生命活动 通过水合作用与脱

8、水作用控制由多亚基组成的结构.,微生物细胞含水量很高，细菌、酵母和霉菌菌体分别是80%、75%和85%，而霉菌孢子含水39%，细菌芽孢含水很低，约为30%左右。,第二节微生物的营养类型,异养型生物,自养型生物,生长所需要的营养物质,生长过程中能量的来源,光能营养型,化能营养型,根据微生物生长所需要的主要营养要素即碳源和能源的不同，可以将微生物划分为不同的营养类型：,根据碳源、能源及电子供体性质的不同， 可将微生物分为：,光能无机自养型(photolithoautotrophy),光能有机异养型(photoorganoheterotrophy),化能无机自养型(chemolithoautotro

9、phy),化能有机异养型(chemoorganoheterotrophy),1光能无机自养型（光能自养型）,能以CO2为唯一或主要碳源；,进行光合作用获取生长所需要的能量；,以无机物如H2、H2S、S等作为供氢体或电子供体，使CO2还原为构成细胞物质的有机物；,例如，藻类及蓝细菌等和植物一样，以水为电子供体（供氢体），进行产氧型的光合作用，合成细胞物质。而红硫细菌，以H2S为电子供体，产生细胞物质，并伴随硫元素的产生。,CO2+ 2H2S,光能,光合色素, CH2O + 2S+ H2O,2光能有机异养型（光能异养型）,不能以CO2为主要或唯一的碳源；,以有机物作为供氢体，利用光能将CO2还原为

10、细胞物质；,在生长时大多数需要外源的生长因子；,例如，红螺菌属中的一些细菌能利用异丙醇作为供氢体，将CO2还原成细胞物质，同时积累丙酮。,CHOH + CO2,H3C,H3C,2,光能,光合色素,2 CH3C0CH3 + CH2O + H2O,3化能无机自养型（化能自养型）,生长所需要的能量来自无机物氧化过程中放出的化学能；,以CO2或碳酸盐作为唯一或主要碳源进行生长时，利用H2、H2S、Fe2+、NH3或NO2-等作为电子供体使CO2还原成细胞物质。,化能无机自养型只存在于微生物中，可在完全无机及无光的环境中生长。它们广泛分布于土壤及水环境中,参与地球物质循环；,4化能有机异养型（化能异养型

11、）,生长所需要的能量均来自有机物氧化过程中放出的化学能；,生长所需要的碳源主要是一些有机化合物，如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等。,有机物通常既是碳源也是能源；,大多数细菌、真菌、原生动物都是化能有机异养型微生物；,所有致病微生物均为化能有机异养型微生物；,不同营养类型之间的界限并非是绝对的,异养型微生物并非绝对不能利用CO2；,自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长；,有些微生物在不同生长条件下生长时,其营养类型也会发生改变:,例如紫色非硫细菌(purple nonsulphur bacteria)： 没有有机物时，同化CO2， 为自养型微生物； 有机物存在时，利用有机物进行生长，为异养型微

12、生物； 光照和厌氧条件下，利用光能生长，为光能营养型微生物； 黑暗与有氧条件下，依靠有机物氧化产生的化学能生长，为化能营养型微生物,微生物营养类型的可变性无疑有利于提高其对环境变化的适应能力,第三节营养物质进入细胞的方式,营养物质能否进入细胞取决于三个方面的因素：,营养物质本身的性质（相对分子量、质量、溶解性、电负性等;,微生物所处的环境（温度、pH等）；,微生物细胞的透过屏障（原生质膜、细胞壁、荚膜等）。,除原生动物外，各种微生物都是通过细胞膜的渗透和选择性吸收作用而从外界吸收营养物质的。,根据物质运输过程的特点，可将微生物营养物质的 运输方式分为：,单纯扩散,促进扩散,主动运输,基团转移,

13、1单纯扩散（自由扩散、简单扩散）,原生质膜是一种半透性膜，营养物质通过原生质膜上的小孔，通过物理扩散方式由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内进行扩散。,特点,不消耗能量；不需要载体；,不能逆浓度运输；运输速率与膜内外 物质的浓度差成正比；,物质在扩散过程中没有发生任何变化；,水是唯一可以通过自由扩散穿过原生质膜的分子；另外脂肪酸、乙醇、甘油、一些气体（O2、CO2）及某些氨基酸分子在一定程度上也可通过自由扩散进出细胞。,2促进扩散,特点,不消耗能量,需要载体参与,不能进行逆浓度运输,运输速率与膜内外物质的浓度差成正比,参与运输的物质的分子结构不发生本身变化，但运输速度加快,细胞外溶质借助于细胞膜上

14、的载体蛋白（酶）的协助， 向胞内运送的方式,。,通过促进扩散进入细胞的营养物质主要有氨基酸、单糖、维生素及无机盐等。一般微生物通过专一的载体蛋白运输相应的物质，但也有微生物对同一物质的运输由一种以上的载体蛋白来完成。,3主动运输,它的一个重要特点是物质运输过程中需要消耗能量和载体，而且可以进行逆浓度运输。用于各种离子和一些糖类的运输。,主动运输是广泛存在于微生物中的一种主要的物质运输方式。,与促进扩散相比, 主动运输有何重要意义?,最关键的是，微生物通过主动运输可以从各种环境中吸收到营养物质，从而对提高其环境的适应性具有重要作用。,4基团移位,基团移位是另一种类型的主动运输，它与主动运输的不同

15、之处在于它有一个复杂的运输系统(酶系统)来完成物质的运输。 其特点是：需要能量，需要载体，可以逆浓度运输，而且物质结构在运输过程中会发生化学变化。,基团移位主要存在于厌氧型和兼性厌氧型细胞中，主要用于各种糖类的运输，脂肪酸、核苷酸、碱基等也可以通过这种方式运输。,比较项目 单纯扩散 促进扩散 主动运输 基团移位 特异载体蛋白 无 有 有 有 运送速度 慢 快 快 快 溶质运送方向 由浓至稀 由浓至稀 由稀至浓 由稀至浓 平衡时内外浓度 内外相等 内外相等 内部高 内部高 运送分子 无特异性 特异性 特异性 特异性 能量消耗 不需要 需要 需要 需要 运送前后溶质分子 不变 不变 不变 改变 载

16、体饱和效应 无 有 有 有 与溶质类似物 无竞争性 有竞争性 有竞争性 有竞争性 运送抑制剂 无 有 有 有 运送对象举例 水、O2 糖、SO42- 氨基酸、乳糖 葡萄糖嘌呤,四种运送营养方式的比较,第四节培养基,培养基: 应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质（混合养料）。,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础,任何培养基都应该具备微生物所需要六大营养要素（碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水）且比例适当.,任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理:,常用高压蒸汽灭菌： 1.05kg/cm2, 121.3, 15-20min； 0.

17、56kg/cm2, 112.6, 15-30min;,绝大多数微生物都可以在人工培养基上生长，除少数严格寄生或共生的微生物外。另外，有一种观点，认为自然界中还存在着一类不可培养的微生物。目前这类微生物作为一种资源已受到广泛关注。,微生物培养基的用途： 促进微生物生长繁殖；积累代谢产物； 分离微生物菌种；鉴定微生物种类； 微生物细胞计数；菌种保藏； 制备微生物制品,1） 生态模拟 调查所培养菌的生态条件，查看其“嗜好”，对“症”下料初级天然培养基. 2） 查阅文献 查阅、分析文献，调查前人的工作资料，借鉴人家的经验，以便从中得到启发设计有自己特色的培养基配方. 3）精心设计 借助优选法或正交试验

18、设计法等方法.,1.设计培养基的方法,4）试验比较 *不同培养基配方的选择比较 *单种成分来源和数量的比较 *几种成分浓度比例调配的比较 *小型试验放大到大型生产条件的比较 *pH和温度试验,2 培养基的类型,按所培养微生物的类群分类 细菌培养基 放线菌培养基 酵母菌培养基 霉菌培养基等 按培养目的来分类 种子培养基(seed culture medium)发酵培养基(fermentation medium) 按培养基的组成成分分类 天然培养基(complex medium)合成（组合）培养基(synthetic medium) 半合成（组合）培养基(semi-defined medium)

19、按培养基的物理状态分类 液体培养基(liquid medium) 固体培养基(solid medium)： 半固体培养基(semi-solid medium) 按培养基的功能（或用途）分类 基础培养基(minimum medium)加富（又称富集）培养基(enriched medium) 鉴别性培养基(differential medium),培养基的种类,1）根据微生物的类群来分 细菌培养基 放线菌培养基 酵母菌培养基 霉菌培养基等。,2）根据培养目的来分 种子培养基(seed culture medium)是为保证发酵生产获得大量优质种子而设计的培养基。 特点是营养较丰富，氮源比例较高。有

20、时为使菌种能迅速适应后面的发酵条件，还有意识地加入发酵培养基的基质。 发酵培养基(fermentation medium)用于生产预定发酵产物，一般以碳为主要元素，碳源含量往往高于种子培养基。大规模生产时，原料应价廉易得，还应有利于下游的分离提取。,如：味精生产 一级种子（北京棒状杆菌AS1.299，用摇床培养）培养基配方：,葡萄糖 3% 玉米浆 2.53.5% 尿素 0.30.5% K2HPO4 0.10.2% MgSO4 0.05%,二级种子（1200升发酵罐）培养基配方： 以3-5%淀粉水解糖代替3%葡萄糖，其他成分同一级种子。,发酵培养基（50-100t发酵罐）： 基本同二级种子液。,

21、3） 根据对培养基成分的了解程度来分 A 天然培养基(complex medium)：也称作chemically undefined medium。 利用化学成分还不完全清楚或不恒定的天然物质（如肉汤、蛋白胨、麦芽汁、酵母汁、豆芽汁、玉米粉、牛奶、血清等）制成的培养基。 天然培养基比较经济，除实验室经常使用外，更适宜于在生产上用来大规模地培养微生物和生产微生物产品。 B 合成（组合）培养基(synthetic medium)：也称作chemically defined medium。 由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。 该类培养基的组成成分清楚，重复性强，但微生物生长较慢，且价格较贵。

22、 故一般适于在实验室范围内及有关微生物营养需要、代谢、分类鉴定、生物测定以及菌种选育、遗传分析等方面的研究工作。 如高氏培养基、察氏培养基等都是合成培养基。 C 半合成（组合）培养基(semi-defined medium)： 在合成培养基的基础上添加些天然成份，以更有效地满足微生物对营养物的需要。如马铃薯-蔗糖培养基。,4 根据培养基的物理状态来分 1） 液体培养基(liquid medium)： 液体培养基不含任何凝固剂，菌体与培养基充分接触，操作方便。 常用于大规模的工业化生产以及在实验室进行微生物生理代谢等基本理论的研究工作。 可根据培养后的“浊度”判断微生物的生长情况。,2） 固体培

23、养基(solid medium)： 天然固体营养基质制成的培养基（如培养霉菌的培养基），或在液体培养基中加入一定量凝固剂（琼脂1.52)而呈固体状态的培养基。 为微生物的生长提供营养表面。 常用于微生物的分离、纯化、计数、生理测定、育种和菌种保藏等方面的研究。 可依使用目的不同而制成斜面、平板等形式.,3）半固体培养基(semi-solid medium)： 在液体培养基中加入0.2-0.7的琼脂构成的培养基。 常用来观察细菌运动的特征，以进行菌种鉴定. 以及测定噬菌体效价等等 .,1.不被微生物分解、利用、液化； 2.不因消毒灭菌而被破坏； 3.在微生物的生长温度内保持固态； 4.凝固点的温

24、度对微生物无害； 5.透明度好，粘着力强,理想凝固剂应具备的条件,半固体培养物的生长情况：,3.5 根据培养基用途来分 3.5.1 基础培养基(minimum medium): 是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养成分的培养基； 基础培养基也可作为一些特殊培养基的基础成分（如制备糖发酵培养基时）.,3.5.2 加富（又称富集）培养基 在基本培养基中加入某些特殊的营养物质，如血、血清、动植物组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。 用来富集（使数量上占优势）和分离某种特定微生物。 或用以培养营养要求苛刻的微生物 .,富集-分离微生物： 根据待分离微生物的特点设计培养基,用于从

25、环境中富集和分离某种微生物 目的微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快,并逐渐富集而占优势,从而容易达到分离到该种微生物的目的.),3.5.3 选择性培养基(selective medium)： 是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要（投其所好），或根据对某种化合物的敏感性情况（取其所抗）而设计出来的一类培养基。 具体说，是加入相应的特殊营养物质或有抑菌性的化学物质, 以抑制不需要的微生物的生长,而促进所需微生物的生长。 用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中 分离出来.,（续上表）,例：伊红美兰（Eosin-Methylene Blue）乳糖培养基（简称EMB培养基）用于食品卫生的

26、微生物学检验，检验食品样品的“大肠菌群”的指标。,3.5.4 鉴别性培养基(differential medium)： 用于鉴别不同类型微生物的培养基。 在普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物以便于根据目的选择性挑取或计数等。,大肠菌群的定义： 指存在与大肠内的，分解乳糖产酸产气的G-短杆菌,包括大肠杆菌和产气肠杆菌和一些中间类型的细菌。,伊红和美蓝二种苯胺染料可抑制G+细菌和一些难培养的G-细菌的生长。在低酸度时, 这二种染料结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用. 试样中的多种肠道菌会在EMB培养基上产生相互容易区分的特征

27、菌落, 因而易于辨认。 例如：大肠杆菌强烈分解乳糖而产生大量的混合酸, 菌体呈酸性,菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光。,选择性培养的结果,鉴别性培养的结果,二 培养基的配制原则,培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确） 营养物的浓度与比例应恰当（营养协调） 物理化学条件适宜（条件适宜） 根据培养目的来选择不同来源的原料（经济节约）,1. 培养基组分应适合微生物营养特点（目的明确）,即根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。 不同营养类型的微生物，其对营养物的需求差异很大。如 自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。 异养型微生物的培养基至少需

28、要含有一种有机物质，但有机物的种类需适应所培养菌的特点。 按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同 当对“试验菌”营养需求特点不清楚的时候，可以采用生长谱法进行测定。,2.营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）,浓度过高微生物的生长受到抑制； 浓度过小不能满足微生物生长的需要； 碳氮比（C/N）直接影响微生物生长与繁殖及代谢产物的形成与积累，故常作为考察培养基组成时的一个重要指标,碳源中所含碳原子的mol数 氮源中所含氮原子的mol数,C/N比值=,例：谷氨酸生产中 C/N 4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少； C/N3/1 时，菌体生长受抑制，而谷氨酸大量增加。,注：C/N比有时

29、也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）,3.物理化学条件适宜（条件适宜）,pH: 各类微生物的最适生长pH值各不相同： 细 菌：7.08.0 放线菌：7.58.5 酵母菌：3.86.0 霉 菌：4.05.8 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，培养基的初始pH值会发生改变，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： 内源调节： 在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐； 调节培养基合适的碳氮比。 外源调节： 按实际需要不断向发酵液中流加酸液或碱液,渗透压和水活度（aw）,渗透压：由溶液中所含分子或离子的质点数决定的，由2种不同浓度的溶液产生的。

30、溶液的质点数越多，产生的渗透压就越大。 等渗溶液适宜微生物生长 高渗溶液细胞发生质壁分离 低渗溶液细胞吸水膨胀，直至破裂,大多数微生物适合在等渗的环境下生长。 而有的细菌如Staphylococcus aureus则能在3mol/L NaCl的高渗溶液中生长。 能在高盐环境（2.86.2g/L NaCl）生长的微生物常被称为嗜盐微生物（Halophiles）。,水活度,在人为或天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水 的含量. 一般用：在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸汽压力与同样条 件下纯水蒸汽压力之比表示，即： aw=Pw/Pow 式中Pw代表溶液蒸汽压力, P0w代表纯水蒸汽压力。

31、纯水aw为1.00。 溶液中溶质越多, aw越小。,微生物一般在aw为0.600.99的条件下生长 aw过低时,微生物生长的迟缓期延长,比生长速率和总生长量减少 微生物不同，其生长的最适aw不同。,氧化还原电势(redox potential),是度量系统中还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的指标，以Eh表示，其单位是V（伏）或mV（毫伏） 各种微生物对培养基的氧化还原电势的要求不同： 好氧微生物：+0.3+0.4V, (在0.1V以上的环境中均能生长) 厌氧微生物：只能在+0.1V以下生长 兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下发酵 培养基是多氧化还原的复杂电化学系统，测出的Eh

32、值仅代表其综合结果。 对微生物影响最大的是：分子氧和分子氢的浓度 培养基中常用的还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。,1.4 根据培养基的应用目的选择原料及其来源（经济节约）,该培养基的应用目的，即： 是培养菌体还是积累代谢产物？ 是实验室种子培养还是大规模发酵？ 代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？,用于培养菌体、种子的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）； 用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）；若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否加入特殊元素或特定的代谢产物； 当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉 的原料，提倡以粗代精，以废代好。,经济节约原则,以粗代精,以野代家,以废代好,以国代进,以简代繁,以氮代朊,以烃代粮,以纤代糖,