荧光光度分析法测定维生素B2-全.ppt

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1、荧光分析法简述,指导教师：赵成国,一 、概 述 什么是荧光呢？当某些物质被光照射后， 它会吸收一定频率的光，而发射出波长更长的 光，当光停止时，发射光也随即消失，这就是 荧光现象，它发出的光就叫荧光。第一次发现 荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物 学家莫纳德斯 （N.Monardes）, 在一种木头 切片的水溶液中，看到了极为可爱的天蓝色， 以此开始了荧光研究。,直到1852年在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，才确立了荧光是光发射的概念。到19世纪末人们已经

2、知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600种以上的荧光物质。,20世纪以来，荧光现象被研究得更多了，发现了共振荧光、增感荧光，能够进行荧光产率得绝对测定，还进行了荧光寿命的直接测定等等。,二、荧光发生机理,当一些物质被光照射后，物质的分子吸收光以后，便以基态跃迁到激发态，成为激发分子，然后通过相互碰撞或和其它溶剂分子碰撞等去活化的过程而消耗了能量，回到第一激发态的最低振动能级，这种跃迁称为无辐射跃迁，它不会发光。当电子由激发态的最低振动能级跃迁回基态的不同振动能级时，则以荧光的形态发出能量。,1. 激 发 通常在室温下物质分子 大部分处于基态的最低振动 能级（ =0）。当电子吸 收一定频率的电磁

3、辐射发生 能级跃迁时，可上升至不同 激发态的各振动能级，其中 大部分分子上升至第一激发 单重态（ S1 ），这一过程 称为激发。,2.去活化过程 处于激发态的分子是不稳定，它可以通过 不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。 去活化过程有以下几种： （1）振动驰豫 溶液中分子间碰撞机会很 多，通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶 剂分子，通过非辐射跃迁而降至同一能态的最 低振动能级，这一过程称为振动驰豫。,（2）内部转换 同一多重态的不同电子能级间可能发生内部转换。 S2 S1或T2 T1 条件：当S2较低振动能级与S1较高振动能级的能量相当，且发生重叠时分子才有可能S2 S1或T2 T1,（

4、3）荧光发射 处于第一激发的 最低振动能级的分 子，跃迁回基态的 各振动能级，这一 过程称为荧光发射。,（4）体系间跨越跃迁 分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态的过程，称体系间跨越跃迁。 三重态：电子自旋方向相同 单重态: 电子自旋方向相反 这些分子从第一激发三重态的最低振动能级下降至第一基态的各振动能级，所发出的辐射即为磷光。,1.激发光谱和发射光谱 任何荧光化合物都有两个特征性光谱：激 发光谱和发射光谱 （1）激发光谱 绘制激发光谱时，固定荧光的最大发射波 长，然后改变激发光的波长，所测得的荧光强 度与激发波长的谱线关系即为激发光谱。,三、荧光的特性,（2）发射光谱 发射光谱简称荧光

5、光谱。绘制发射光谱 时，固定荧光的最大激发波长，然后改变发射 光的波长，所测得的荧光强度与发射波长的谱 线关系即为发射光谱。,2.荧光光谱形状与激发波长无关 由于分子无论被激发到高于S1哪一个激发 态，都经过无辐射的振动驰豫或内部转换等过 程，最终回到S1态的最低振动能级，然后跃迁 回基态产生荧光。,3.吸收光谱和荧光光谱有很好的镜像关系 由于分子的S0态和S1态中各振动能级的能量分 布情况相似决定的。因此吸收光谱和发射光谱的形 状相似。,蒽的吸收光谱和发射光谱, 吸收光谱 发射光谱,四、荧光与分子结构的关系,（）发光分子中要具有共轭键体系 共轭的程度越大，电子越容易激发，分子 放光越容易产生

6、。,（2）具有刚性平面结构分子有利于荧光发射 分子的共平面越大，其电子的共轭程度越大。如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光素有很强的荧光，而酚酞没有，这是由于荧光素有刚性平面结构，减少了分子振动，减少了去活化的概率。,（3）取代基的作用,给电子基增强荧光: OH, NH2,NHR, NR2,CN,吸电子基减弱荧光：Br , Cl , NO2, NN, COOH,五、影响荧光强度的因素,1.荧光的减退 荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化 作用，会使荧光逐渐减退。,2.荧光强度与溶液浓度的关系 在稀溶液中： FKc F 为荧光强度 K检测效率（由仪器决定） c 为液体的浓度,F,c,高浓度时，荧光

7、物质发生熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线性关系,3.温度的影响 温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度 下降时，介质的粘度增大，荧光物质与分子的 碰撞也随之减少，去活化过程也减少，则荧光 强度增加。相反，随着温度上升，荧光物质与 分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加，则 荧光强度下降。,带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化 合物的荧光一般都与溶液PH值有关，例如：在 pH=712的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出 蓝色荧光；而在pH13的溶液中苯胺以离 子形式存在，都不会发出荧光。同时所用酸的种 类也影响荧光的强度，例如：奎宁在硫酸溶液中 的荧光比在盐酸中的要强。,4. pH的影响,许多有机物及

8、金属的有机络合物，在乙醇 溶液中的荧光比在水溶液中强。乙醇、甘油、 丙酮、氯仿及苯都是常用的有机溶剂，其中大 多有荧光，应设法避免；一般避免的办法是稀 释，或加入一部分水。,5.溶 剂,6.荧光强度达到最高点所需要的时间不同，有 的反应加入试剂后荧光强度立即达到最高峰。有 的反应需要经过1530分钟才能达到最高峰。,7.有机溶剂中常有产生荧光的杂质，可用蒸馏法提纯。橡皮塞、软木塞及滤纸中也常有能溶于溶剂的一些带荧光的物质。,包括有光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置五个部分。,六、荧光分析仪器的基本组成部件,激发光源应具有足够的强度、适用波长范围 宽、稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙

9、弧 灯。 氙弧灯又称氙灯，是目前荧光分光分度计中 应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电 灯，外套为石英，内充氙气，光强度大氙灯的灯 内气压高，启动时的电压高（2040KV）,因此使 用时一定要注意安全。,1. 激发光源,荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器 单色器有两块： 第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长； 第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。 一般后者的光栅闪耀波长比前者来得长一些。 第一滤光片用以分离出所需用的激发光，第二滤 光片用以滤去杂散光、拉曼光和杂质所发射的荧光。,2. 单色器,荧光分析的比色皿通常用石英材料做成，荧光比色皿四面均为磨光透明面，同时一般仅有一

10、种厚度为1cm的液池。,3.样品池,4. 检 测 器,荧光计多采用光电倍增管进行检测。检测器的方向应与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。,5. 记录、显示装置,荧光仪的读出装置有数字电压表或记录仪。现代仪器都配上计算机，进行自动控制和显示荧光光谱及各种参数。,荧光分析仪,光源,样本池,第一（激发） 单色器,第二（发射）单色器,检验器,显示、记录装置,七、荧光测定方法,1.标准曲线法 将已知量的标准物经过与试样相同的处理 后，配成一定浓度的标准溶液，并测定他们的 荧光强度，绘制一条以荧光强度和标准溶液浓 度的标准曲线，然后测定未知样的浓度。,（2）荧光猝灭法 在一般荧光分析

11、中，荧光的猝灭现象是不 可避免的，但是我们可以利用猝灭现象，进行 荧光分析。例如一物质本身不会发光，也不会 与其它物质形成荧光物质，但它会使另外一种 会发射荧光的物质荧光强度降低，荧光强度的 下降程度与该物质的浓度成比例，此法成为荧 光猝灭法。,1.特 点 灵敏度高：测定下限0.10.001 gmL-1,比分光光度法高24个数量级. 仪器设备相对简单、 体积小 操作较简便 反应时间也较快,八、荧光分析法的特点及应用,生物化学分析、生理医学研究、临床检测 （1)直接测定能产生荧光的物质 带苯环 的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸 (2)测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的 物质 荧光生色团标记

12、蛋白质，研究蛋白质 的结构；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光 (3)荧光熄灭法测定猝灭剂,2.荧光光度法的应用,实验一 荧光法测定医用维生素B2中核黄素的含量,1.学习和掌握荧光光度分析法的基本原理和方法 2.学会使用荧光分光度计,一、实验目的：,核黄素易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。核黄素在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测核黄素时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。,二、实验原理,化学名：7,8-二甲基10(2S,3S,4R) - 2,3,4,5-四羟基戊基苯并蝶啶-2,4（3H， 10

13、H）-二酮 分子式：C17H20N4O6 分子量：376.36,三、实验仪器,RF-5301PC荧光光度计 日本岛津公司,1.仪器介绍 拥有世界最高水平的S/N，可达到150以上。最适合高灵敏度、高分辨率测定。其主要参数和特点 测定范围：220900nm 带 宽：1.5、3、5、10、20nm 灵敏度：S/N150 测定方式：定性分析、同步光谱分析、定量分析、时间过程测定。,打开电脑和RF-5301系统的开关，点击桌面的RF-5301的快捷图标，启动仪器的控制程序 从“Acquire Mode”菜单中选Spectrum光谱，进入光谱模式。,2.操作规程,从“Configure设置”菜单中选择P

14、arameters参数,若样品激发光谱的发射波长或发射光谱的激 发波长未知，则在上述对话框中设置合适的激发 发射狭缝宽度，灵敏度，放置标样，在光度计按 键中点击 ，在弹出的对话框中选择激发光 和发射光的范围以及激发光的波长的间隔，点“Search”键，等待一段时间，由仪器给出 最优波长。,扫描完成后出现的谱图,定量分析的参数设置,设置激发发射光波长，激发发射狭缝宽度，灵敏度， 反应时间，单位，浓度以及强度范围。,将装有蒸馏水的样品池放入池槽中，点击“ ”自动回零。,将第一个标准样品装入池槽中，点击 弹出如下对话框，输入标准样品的浓度,以此测完5个标准样品后，屏幕上会 出现工作曲线，也会出现标准

15、曲线方程。,在工作曲线绘制完成后，可以定量测定未知样的浓度，点击 。然后将未知样品放入池槽中，点击 开始浓度的测定。,最后，在File菜单中选择Save，储存获得的数据,1. 10.0 gmL-1核黄素标准溶液的配制： 称取0.01g核黄素置于50mL烧杯中，以 蒸馏水溶解后，定溶于1000mL容量瓶中，摇 匀，备用。,四、实验试剂,1.配制系列标准溶液取4个 50 ml容量瓶，分别加入 1.00，2.00， 3.00，4.00 ml核黄素标准溶液，用水稀释至刻度， 摇匀。 2.扫描核黄素的最大激发波长和发射波长 对核黄素标准溶液进行荧光扫描，根据激发光谱 曲线和发射光谱曲线，确定最大激发波长

16、和最大发射 波长。,五、实验步骤,3.标准曲线的绘制 根据上述核黄素标准溶液的荧光强度，绘制标准 曲线。,4.未知试样的测定 取医用维生素B2片剂1片，置于50mL烧杯中，加 少量蒸馏水溶解，定溶于1000ml容量瓶中，摇匀、备 用。,六、数据处理,2）核黄素标准溶液浓度及其荧光强度,4）计算药片中核黄素的含量，用mg/片表示,3) 绘制核黄素的标准曲线,1）记录核黄素的最大激发波长和最大发射波长,EX EM,在实验中，拿比色杯要拿4个棱角，切勿 拿光滑的透光面，以免影响检测效果 比色杯用后，应用醇或其它有机溶剂浸 泡。 氙灯长时间使用（1000h以上）后可能 会发生爆炸，所以保证期（500h）以后，应及 时更换。 在安装或更换氙灯时，应确认电源开关 为OFF，并切断电源。,七. 使用注意事项,八、思考题 1. 荧光分光光度计与紫外分光光度计的两点主要区别是什么？ 2. 荧光产生的机理？ 3. 荧光分光光度计的比色皿为什么四面透光？ 4.为什么荧光分光光度计入射光源和检测器的方向是垂直的？ 5.为什么不能在碱性环境下检测核黄素？,