分子诊断技术的临床应用.ppt

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1、分子诊断技术的临床应用现在学习的是第1页，共30页 狭义的分子诊断是基于核酸的诊断技术，是通过对DNA或RNA的检测来实现对疾病的检测和诊断。但是，随着第一张人类基因组测序图的完成，以及由此而带来的基因组学、蛋白组学、代谢物组学等新兴学科的发展，分子诊断的内涵已经从单纯的DNA/RNA拷贝、突变等变化的检测，拓展到核酸与DNA片段、蛋白与多肽、抗原与抗体、受体与配体等生物大分子的检测，并广泛应用于疾病的筛查、诊断、治疗监测、预后与预防等生命科学的各个领域。一、分子诊断的概念现在学习的是第2页，共30页根据分子诊断技术特征划分为三类：一、基于分子杂交为基础的分子诊断技术 两条同源核酸分子（DNA

2、或RNA）可以在碱基互补的原则下形成异质双链是遗传物质最重要的化学特征，这一过程亦被称为分子杂交。分子杂交是所有分子生物学技术的基础，从最初的印迹杂交到聚合酶链反应（PCR），从基因芯片再到高通量的DNA测序技术，都离不开碱基互补的分子杂交反应。现在学习的是第3页，共30页二、基于测序技术为基础的分子诊断技术 DNA的序列分析是分子诊断学的金标准，各种遗传疾病，病毒或细菌的感染与变异，在基因表达水平上的个性化用药，多基因疾病的诊断与预测，最终都可以借助基因测序平台的应用。现在学习的是第4页，共30页三、基于扩增技术为基础的分子诊断技术 1983年Mullis发明了聚合酶链反应（Polymera

3、se chain reaction，PCR），使体外扩增DNA成为可能，开启了体外扩增和操作DNA或RNA技术的发展。到现在，扩增DNA的技术已经成为分子诊断应用最广的技术之一，并发展变化了数十种核酸扩增检测技术。现在学习的是第5页，共30页二、PCR概述（一）PCR概念 PCR PCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）即聚合酶）即聚合酶链反应，是指在链反应，是指在DNADNA聚合酶催化下，以母链聚合酶催化下，以母链DNADNA为模为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸

4、等步骤，体外复制出与母链模板伸等步骤，体外复制出与母链模板DNADNA互补的子链互补的子链DNADNA的过程。是一项体外核酸扩增技术，能快速特的过程。是一项体外核酸扩增技术，能快速特异地在体外扩增任何目的异地在体外扩增任何目的DNADNA。现在学习的是第6页，共30页 PCR技术能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。二、二、PCR概述概述现在学习的是第7页，共30页九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用于临

5、床检测PCR 发展简史发展简史1983 Mullis于12月16日成功发明了PCR1985 关于PCR 的文章首次由 Mullis及其同事等人 在Science杂志上发表1989 12月Science杂志将PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993 10月13日 Mullis获诺贝尔化学奖 1995 荧光定量PCR技术出现现在学习的是第8页，共30页PCR技术 PCR核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的Taq酶，使扩增反应不需要每一个循环加一次DNA聚合酶，从而实现了自动化，使应用领域迅速扩大，PCR技术成为了分子生物学中的一项突破性技术。现在学习的是第9页，

6、共30页PCR概述2000至2013年发表论文1280748篇现在学习的是第10页，共30页二、PCR概述（二）原理双链DNA 变性 退火 延伸 （膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交） （DNA合成）不断重复PCR循环次数与循环次数与DNA产量关系产量关系现在学习的是第11页，共30页 高灵敏度高灵敏度 高特异性高特异性 简便快捷简便快捷 高效扩增、忠实复制！高效扩增、忠实复制！PCR反应的特点现在学习的是第12页，共30页三、荧光定量PCR技术的临床应用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因检测优生优育项目诊断

7、：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱疹病毒（HSV）、弓形虫（TOX）、风疹病毒（RUB）其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等一 病原体检测现在学习的是第13页，共30页常规结核病实验室诊断方法及不足1. 痰涂片作抗酸染色：阳性率低 、费时2. 细胞培养“金标准”：周期太长(4-8W)3. 血清学诊断： a. 接种BCG可出现阳性 b. 不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人 c. 交叉反应，假阳性不能早期诊断！容易漏诊、误诊！现在学习的是第14页，共30页荧光定量PCR检测TB-DNA的意义1. 能稳定检测10copy的TB-DNA ，灵敏度高 ，特异

8、性强2. 早期、快速、准确地诊断结核病。 痰液、肺及支气管灌洗液肺结核 血液播散性结核和各脏器的结核病 脑脊液中枢神经系统结核病 宫颈拭子、尿道拭子泌尿生殖道结核病现在学习的是第15页，共30页3. 荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。 4. TB-DNA浓度可用于判断疗效： 痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势 ，TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据 荧光定量PCR检测TB-DNA的意义现在学习的是第16页，共30页二 肿瘤相关基因表达的检测：1、包括癌基因、抗癌基因2、肿瘤转移基因3、转移抑制基因三、荧光定量PC

9、R技术的临床应用现在学习的是第17页，共30页三 遗传病1、等位基因检测2、多基因遗传病的突变检测3、基因表达异常所致遗传病检测三、荧光定量PCR技术的临床应用现在学习的是第18页，共30页四 其它应用1. 法医学鉴定2. 抗病毒药物疗效的观察、指导3. 缩短诊断的窗口期三、荧光定量PCR技术的临床应用现在学习的是第19页，共30页窗口期：窗口期：所谓所谓“窗口期窗口期”, ,是指从感染病原体开始是指从感染病原体开始, ,直直至用某种检测方法能够检测到该病原体存在至用某种检测方法能够检测到该病原体存在为止的这一段时间。为止的这一段时间。美国美国9090以上输血传播以上输血传播HIVHIV和和H

10、BVHBV以及以及7575以上输血以上输血HCVHCV的危险性均来自的危险性均来自“窗口期窗口期”感染献血。感染献血。现在学习的是第20页，共30页提供直接证据缩短提供直接证据缩短“窗口期窗口期”PCR检测的临床意义检测的临床意义项目ELISA窗口期项目NAT窗口期HBsAg50HBV20-25抗-HCV70HCV10-14抗-HIV15HIV10现在学习的是第21页，共30页RNA+ Ab-P24+ Ab -血清阳转后的方法RNAp24Ab血清阳转抗体检测临界值 特异性抗体比例时间反应指标感染 血清阳转前的方法怎样检测怎样检测HIVHIV早期感染早期感染? ?现在学习的是第22页，共30页

11、婴幼儿感染婴幼儿感染HIV诊断：诊断：12月内核酸检测，月内核酸检测，13-17月先抗体，阳性者检月先抗体，阳性者检测核酸，测核酸，18个月以上抗体检测个月以上抗体检测现在学习的是第23页，共30页四、四、PCR检测的标本采集要求项目项目标本采集标本采集所需容器所需容器CTCT男性：男性： 尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道约尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道约2 24 4厘米，旋转数圈取出分泌物（应略带厘米，旋转数圈取出分泌物（应略带粘膜），前列腺液、精液。粘膜），前列腺液、精液。女性：女性： 阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去宫阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内颈外分

12、泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停，停5 5秒后旋动棉拭子采取分泌物。尿道秒后旋动棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上分泌物：同上一次性一次性无菌带无菌带盖的试盖的试管。管。NGNGUUUUTPTPHPVHPVHSVHSV现在学习的是第24页，共30页项目项目标本采集标本采集HBVHBV无菌注射器抽取无菌注射器抽取2 2毫升静脉血或其它体液注入毫升静脉血或其它体液注入无菌试管或抗凝管。无菌试管或抗凝管。HCVHCVEBEB1.1.鼻咽拭子或体液标本。鼻咽拭子或体液标本。 2.2.也可取抗凝血标本也可取抗凝血标本, ,但一般不推荐。但一般不推荐。CMVCMV1.1.尿液：中段晨尿尿液：中段晨尿20

13、ml20ml于加盖试管。于加盖试管。其他体液标本或咽拭子。其他体液标本或咽拭子。也可取抗凝血标本也可取抗凝血标本, ,但一般不推荐。但一般不推荐。TBTB1.1.痰液：患者深部咳痰痰液：患者深部咳痰1 13ml3ml于无菌加盖试管。于无菌加盖试管。2.2.其他组织标本：留于无菌试管。其他组织标本：留于无菌试管。3.3.也可取抗凝血标本也可取抗凝血标本, ,但需分离单个核细胞检但需分离单个核细胞检测，阳性率才会高。（于发热时抽取）测，阳性率才会高。（于发热时抽取）MPMP 咽拭子咽拭子现在学习的是第25页，共30页五、NAT（核酸检测）技术类型：现在学习的是第26页，共30页实时荧光核酸恒温扩增

14、检测技术（SAT）实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）是将核酸恒温扩增和实时荧光检测相结合的一种新型核酸检测技术。国内公司（上海仁度生物科技有限公司）自主研发，拥有一整套自主知识产权和核心技术。现在学习的是第27页，共30页（SAT）技术原理： 同一温度下（42），以RNA为起始模板，通过M-MLV反转录酶产生一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个（1001000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况。现在学习的是第28

15、页，共30页SAT 检测技术的优势：检测靶标：RNA 灵敏度高，特异性强，易鉴别死菌、活菌，适合临床判愈;扩增产物：RNA 高效扩增，低污染;核酸提取：磁珠法 提取纯度高 结果准确;检测方法：实时荧光检测，扩增、检测同时进行全程监控;扩增方式：42恒温 无需热循环，设备成本低。现在学习的是第29页，共30页总结 分子诊断技术经历近30年的快速发展，已经形成了主要以杂交、测序和扩增三种反应模式为主的测试技术群，并且在临床诊断中获得了广泛的应用。原位杂交为主的技术对于检测基因表达异常的遗传性疾病具有明显的优势，已成为细胞遗传学实验室最有力的检测工具之一。而全基因组测序技术的快速发展，使得高通量的测序方式来检测全基因的表达差异或突变检测的成本均大大降低，而且测试速度将逐渐适合临床的需求，因此对于大量基因的表达和突变检测，高通量测序技术的优势将会越趋明显。另一方面，RT-PCR、STA等PCR技术对于感染性疾病、低突变位点或变异的检测，在成本上明显优于前两者，因此PCR技术可能在临床上拥有更好的应用空间。 不同的技术平台有各自的优缺点，我们要针对不同的实验标本对象及需求,选择适合的技术方法，力求在“高效,高质量,低成本”这三者间找到合适的平衡点。现在学习的是第30页，共30页