某某公司高效液相色谱法检测大豆异黄酮含量.PDF

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1、粮油食品科技第1 4 卷2 0 0 6 年 第6 期 油脂开发 高效液相色谱法检测大豆异黄酮含量 徐 颖 ( 陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 成阳 7 1 2 0 8 1 ) 摘 要 ： 采用超声波法提取豆粕 中大豆异 黄酮， 通 过高效 液相 色谱法测定其含 量。确定 色谱 条件 为： 色谱柱 Wa t e r s R P 1 s ( 5 m， 3 91 5 0 m m) ， 流动相 甲醇 ： 水 ： 磷 酸 =5 2： 4 8 ： 0 2 ， 柱 温 3 0 ， 流速 0 7 m L m i n 。 检测波长 2 6 0 n m。该测定方法变异 系数 ( R S D) 小 于 3

2、。采 用高效液相 色谱 法测 定异 黄酮含量， 具有灵敏、 准确 、 重现性好等优点。超声提取法具有缩短提取 时间和 简化 工艺等优点。 关键词 ： 超声波法； 大豆异黄酮； 高效液相 色谱 法 中图分类号 ： T s 2 1 1 4 3 文献标识码 ： A文章编号 ： 1 0 0 7 7 5 6 1 ( 2 0 0 6 ) 0 63 3 0 3 De t e r mi n a t i o n o f t h e s o y b e a n i s o fl a v o n e c o n t e n t b y HP LC XU Yi n g ( L i f e S c i e n c eE

3、 n g i n e e ri n g C o l l e g e 。S h a a n x i U n i v e r s i t y o f S c i e n c eT e c h n o l o g y ， X i a n y a n g 7 1 2 0 8 1 ) Abs t r a c t ： Ex t r a c t i n g i s o fl a v o n e f r o m s o y r e s i du e b y u l t r a s o n i c wa v e， t h e n t h e me t h o d t o d e t e r mi n e i t

4、 b y h i s h p e rf o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g ra p h y( H P L C )w a s d e s c r i b e d T h e c o l u t n n i s Wa t e rs S y m m e t r y C o l u m n ( R P l 8 ， 5 m， 3 9 1 5 0 m m) T h e m o b i l e p h a s e i s Me O H： H 2 O： H 3 P O 4 ( 5 2 ： 4 8 ： 0 2 ) ，t h e t e m p e rat u

5、 r e o f c o l u m n i s 3 0 ， t h e w a v e l e n g t h i s 2 6 0 n m， t h e fl o w rat e i s 0 7 mL m i n，Th e R S D w a s l e s s t h a n 2 I t i s c o n c l u d e d t h a t t h i s m e t h o d i s s e n s i t i v e 、 a c c u r a t e a n d r e p r o d u c i a b l e Ke y wo r d s： u l t r a s o n

6、i c wa v e me t h o d； s o y b e a n i s o fla v o ne； HPL C 0 前言 大豆异黄酮是一种新兴的备受人们青睐的天然 植物雌激素 ， 具有 明显 的抗氧化作用 ， 可广泛应用于 食品、 医药等行业 。大豆异黄酮是属于黄酮类 化合 物中的异黄酮类成分。其母核 为 3 一苯并吡 喃酮 ， 目前发现的大豆 中异黄酮共有 1 2种 ， 分为游离型的 甙元和结合 型 的糖 甙 两 类 ， 甙 元 占总量 的 2 3 ， 包括金雀 异黄素 ( G e n i s t e i n ) 、 大豆素 ( D a i d z e i n ) 和黄豆甙( G

7、l y c i t e i n ) 。糖甙占总量的 9 7 一 9 8 ， 主 要以 金 雀 异 黄 甙 ( 染 料 木 甙 ， G e n i s t i n ) 和 大 豆 甙 ( D a i d z i n ) 及丙二酰金雀异黄甙 ( 6 - 0 m a l o n y l g e n i s t i n ) 和丙二 酰大豆甙 ( 6 ” O m a l o n y l d a i d z i n ) 形式 存在 ， 约 占总量的 9 5 L l 。 超声波具有空化、 粉碎 、 搅拌等特殊作用 ， 对原 料的细胞有破坏现象 ， 增大 了物质分子运动 的频率 和速度 ， 增加了溶剂 的穿透

8、力， 使溶剂更充分地渗透 到原料 的细胞 中， 提高 了有效成分溶 出速度和数量 ， 收藕 日期 ： 2 0 0 6 0 32 1 作者简介 ： 徐颖( 1 9 7 8 一) ， 女 ， 黑龙江哈尔滨人 。 硕士 。 讲师 使其更好地溶 于溶剂 中 。通过分离 、 提纯 ， 以获得 所需 的成分。超声提取法的优点是可 以大幅度地提 高有效成分 的提取率 ， 缩短 提取时 间 ， 提高工作 效 率 ， 节省溶剂 ， 简化提取操作步骤。 1 试 验材料 与方法 1 1 仪器 美 国 Wa t e rs公 司 的高效 液相色谱 仪定量 系统 测定样品中大豆异黄酮的含 量 ( 以 G e n i s

9、t e i n作为定 量的标准物质) ， 色谱系统包括 ： Wa t e rs 6 0 0泵 、 Wa t e rs 6 0 0控制 器 、 光 电二极管 阵列检测 器 ( Wa t e rs 2 9 9 6 P h o t o d i o d e A r r a y D e t e c t o r ) 、 在线脱气机 、 M i l l e n n i u m 3 2色谱工作 站。 超纯水机 ： E L G A P U R E L A B Ma x i m a 英国。 超声波发生器 ： S C Q 一 2 5 0型 ， 频 率 3 33 K H z上 海 申波超声公司。 电热恒温鼓风干燥箱

10、： 1 0 1 1 B上海福玛 实验设 备有限公司。 1 2 原料与试剂 大豆粕 ： 购于黑龙江省三棵粮库 。 圈 维普资讯 http:/ 油脂开发 粮油食品科技第1 4 卷2 0 0 6 年第6 期 波长 ， 选用 2 5 4 n m为测定波长。鉴 于本文 以 G e n i s t e i n作为定量的对象 ， 所以， 确定检测波长为2 6 0 n m。 异黄酮标准品 G e n i s t e i n 、 G e n i s t i n 、 D a i d z e i n ： 安徽 天然有机化合物信息中心。 甲醇 、 磷酸 ： 色谱纯。 超纯水 ： 将去离子水经超纯水机而制得。 1 3

11、试验 方法 1 3 1 样品处理超声波法 将豆粕用粉碎机粉碎 ， 过 2 0目筛 ， 称取 2 0 g ， 置 于 5 0 0 m L碘量瓶 中， 用 1 6 0 m L 6 5 乙醇溶解 ， 超声 波提取一定的时间， 抽滤去除滤渣 ， 用量筒量取滤液 体积， 然后将 滤液用 0 2 m o l L盐 酸在 8 5 下水解 2 h ， 用 4 0 N a O H溶液调 p H至中性 ， 取出部分水解 液 ， 用旋转蒸发器浓缩去溶剂 ， 浓缩液用等量的乙酸 乙酯萃取纯化， 取酯相( 上层) 浓缩， 得到纯化液， 用 1 0 m L容量瓶 ， 甲醇定容 ， 经 0 4 5 t t m滤膜过滤 ，

12、用高 效液相色谱仪测定其大豆异黄酮的含量。 1 3 2 标准曲线的绘制 精密称取金雀异黄素( G e n i s t e i n ) 标准品3 3 2 m g ， 置于 1 0 m L容量瓶 中， 以甲醇溶解 ， 并定容 至刻度 ， 摇匀 ， 作为标样储备液l 3 J 。准确吸取 0 2 、 0 4 、 1 0 、 2 0 、 3 6 m L 标样储备液分别置于 1 0 m L容量瓶 ， 用 甲 醇定容至刻度 ， 摇匀。将 标样 液经 0 4 5 t t m滤 膜过 滤 ， 每次进样 2 0 t t L ， 在 高效液相色谱仪按 照前 述的 色谱条件得到色谱 图， 然后按照相同的处理方法对 各

13、色谱 图进行积分定量 ， 以峰面积 为纵坐标 ， G e n i s t e i n的浓度为横坐标绘制标准曲线 。 标准曲线 的回归方程为 Y=2 0 11 0 X+8 2 2 l o 4，Y 为 峰 面 积 ， x 为 G e n i s t e i n的 含 量 ， R= 0 9 9 9 3。 1 3 3 色谱条件 色 谱 柱 ：Wa t e r s S y m m e t r y C o l u m n s S y m m e t ry S h i e l d T M R P 1 8 ( 5 t t m， 3 91 5 0 m m) 流动相 ： 甲醇 ： 水 ： 磷酸 = 5 2 ： 4

14、 8 ： 0 2 ， 柱温 ： 3 0 o C， 流速 ： 0 7 m l m i n ， 进 样量 ： 2 0 t t L ， 检 测波长 ： 2 6 0 n m， 分析时间 ： 3 0 ra i n 样品。 以保留时间定性、 峰面积定量 、 外标法计算 。 2 结果与讨 论 2 1 检测波长的选择 对混合标样进行 紫外扫描 ， 从 2 1 04 0 0 n m， 见 图 1 ， 得 知 G e n i s t i n的最 大 吸收 波 长 为 2 5 8 4 n m， D a i d z e i n的最大吸收波长为 2 4 7 8 n m， G e n i s t e i n的最 大吸收波

15、长为 2 5 9 6 n m， 兼顾三种物质 的最大吸收 圃 图 1 标样紫外吸收光谱 2 2 色谱图 选用 甲醇 i 水 ： 磷酸 =5 2 ： 4 8 ： 0 2 ， 柱温 3 0 o ( ： ， 流 速 0 7 m L m i n ， 进标样考察色谱 图， 结果见图 2 。 围 2 标 样 色谮 图 G e n i s t i n的保 留时 间为 5 8 0 8 ra i n ， D a i d z e i n的保 留 时 间 为 9 2 3 2 m i n ， G e n i s t e i n 的 保 留 时 间 为 2 2 8 4 6 m l n ， 满足对分离时间的要求 ， 所

16、以， 将此色谱 条件确定为测定 G e n i s t e i n含量的色谱条件 。将经过 处理的样品进样 ， 结果见图 3 。 o o o o o AU0 0 0 0 0 图 3 样 品色谱 图 2 3 提取时间试验 在其他条件相 同的情况下 ， 考查不 同的超声 波 提取 时间对异黄酮提取量 的影响 ， 将提取时间选定 维普资讯 http:/ 粮油食品科技 第1 4 卷 2 0 0 6 年 第6 期 油 脂开发 为 3 0 、 4 5 、 6 0 、 7 5 m i n四个水平 ， 结果见 图 4 。 4 0 3 5 3 0 2 t 盛 2 0 l 5 1 0 提 取 时 l 司( m n

17、) 圈 4 提取时间对提取量 的影响 2 4 精密度试验 将同一样 品连续 进样 5次 ， 分析 测定 G e n i s t e i n 的含量 并记 录保 留时间和进 行统计 分析 ， 结 果见 表 1 。 墨 堑型塞 笪查堡 次 数 n - z ， s 霜 萋 保 声 问 2 2 7 4 l 2 2 8 4 8 2 2 7 8 5 2 2 8 1 9 2 2 8 4 9 2 2 8 0 8 0 0 4 5 9 0 2 0 l nl n ( )6 8 1 5 6 6 4 8 0 0 6 8 6 ， 6 6 8 4 6 ， 6 3。 。 - 2 4 3 结论 ( 1 ) 超声提取法与化学溶剂

18、法提取相 比， 具有大 幅度地提高有效成分的提取率 ， 缩短提取时间 ， 提高 工作效率 ， 节省溶剂 ， 简化提取操作步骤等优点。 ( 2 ) 通过对测定异黄酮色谱条件的摸索试验 ， 建 立 了 如 下 色 谱 条 件 ： 色 谱 柱 为 Wa t e r s S y m m e t r y S h i e l d T M C o l u m n (R P 1 8 ， 5 p t m， 3 91 5 0 m m) ， 流动相 为甲醇 ： 水 ： 磷 酸 =5 2： 4 8： 0 2 ， 柱 温 3 0 ， 流速 0 7 m L m i n ， 检测波长 2 6 0 n m。 ( 3 ) 通过

19、单 因素试验 ， 得知超声波法提取大豆粕 异黄 酮 的最 佳 时 间 为 4 5 ra i n ， 产 品 的 纯 度 达 到 8 2 1 。 参考文献： ( 1 崔 洪斌 主编 大豆生物活性 物质的开发 与应用 M 北京 ： 中国轻 工 业出版社， 2 0 0 1 ( 2 郭孝武 一种 提取 中草药 化学成分的方法 超声提取法 J 天 然 产物研究与 开发。 1 9 9 9 。 1 1 ( 3 ) ： 3 7 4 0 3 张炳文等 糖 苷型大 豆异黄酮 酸水 解工艺 的研 究 J 食 品科 学 ， 2 o o 2 , 2 3 ( 6 ) ： 7 5 7 8 0 ( 上接第 3 0页) 的干燥

20、器具进行对比， 结果见表 2 。 裹 2不同害器对 白银豆干燥的影响 干燥 器具 对 白银豆 品质的影 响 米筛 大孔托盘 细孔钢盘 不好翻动 。 干燥所需 时间为 5 h 好翻动 ， 干燥所 需时间为 B h 。 好 翻动 ， 干燥所 需时间为 5 h 。 3 3 配方的选择 本试验选用膨化大米粉 、 白银豆粉 、 大豆粉的配 方不同直接影响产 品的综合品质 ， 为此设计正交试 验表见表 3 。由正交试验结果得 A 2 B 3 C 组合综合品 质最好 ， 即白银豆粉配方为 5 5 g ， 膨化大米粉 为 2 0 g ， 豆奶粉为 5 g 最佳。 裹 3 白银豆即食糊正 交因素 水平裹 k(

21、3 。 ) 4 质 量标准 4 1 感官指标 色泽 ： 淡黄色 ， 均匀一致 。 组织状态 ： 呈粉状 ， 干燥松散 ， 无结块 ， 无霉变。 口感 ： 细腻适 口， 甜度适 中 ， 能迅速成糊状 。 4 2理化 指 标 水分 8 砷 ( 以 A s 计) 1 0 m g k g 铅 ( 以 P b计) 2 0 m g k g 食 品添加剂按 G B 2 7 6 0的规定 4 3 微 生物 指标 菌落总数( 个 g ) 3 0 0 0 0 大肠菌群 ( 个 1 0 0 g ) 9 0 致病菌( 沙门氏菌、 志贺氏菌、 金黄色葡萄球菌 ) 不得检出 5 经济效益( 估算) 主要 设 备投 资 额 约 3 0万元 ， 以 日产 2 0 0 0袋 ( 4 8 0 g 袋 ) 计 ， 定 出厂价 6 0元 袋 ， 项 目达设 计要 求 ， 年 处理 白银豆 1 2 0 0 t ， 产 值 6 0 0万元 ， 年创 税利 1 0 5万 元 。 6 结论 ( 1 ) 即食 白银豆复合糊 由多种原料组成 ， 根据营养学 原理 ， 比例搭配适当 ， 营养价值 比单独的白银豆糊有 大大提高。 ( 2 ) 本产 品采用超微粉碎 ， 口感香甜 ， 且具有速溶性 ， 用开水冲调后 即可食用 ， 本产品含水分较低 ， 采用密 闭包装， 因而其货架期大为延长。0 国 维普资讯 http:/