基因工程工具酶 (3).ppt

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1、现在学习的是第1页，共63页 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，如限制性核酸内切酶，连接酶，DN聚合酶聚合酶等等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为作。所以把这些酶称之为“工具酶工具酶”。工具酶是对。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。产生的生物工程产品。 基因工程工具酶基因工程工具酶现在学习的是第2页，共63页 自然界的许多微生物体内存在着一

2、些具有特自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降进而降解非己解非己 DNA 的防御工具。在研究掌握了利用这些酶的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。的基因工程工具。基因工程工具酶基因工程工具酶现在学习的是第3页，共63页l限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶主

3、要用于DNA分子的特异切割lDNADNA连接酶连接酶用于DNA和RNA的连接lDNADNA聚合酶聚合酶用于DNA和RNA的合成l核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰l核酸酶核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割lDNA甲基化酶甲基化酶用于DNA分子的甲基化 l其它酶类其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。现在学习的是第4页，共63页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction enzyme)限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction enzyme)l限制性内切酶的发现 l限制性内切酶的分类 l限制性内切酶的命名 l限制性内切酶的活性

4、单位 l限制性内切酶的切割特点 l限制性内切酶的反应条件 l限制性内切酶的应用 现在学习的是第5页，共63页l核酸酶可分为两类：l核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；l核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3，5磷酸二酯键，将核酸链切断。 现在学习的是第6页，共63页限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现l 细菌的限制细菌的限制修饰作用修饰作用1952 年，Luria 和 Human， 1953年，Bertani 和 Weigle 发现细菌的限制（restriction）现象：Phage（k） E.coli kE .col

5、i B【E .coli B 限制限制 （k）】感染不感染现在学习的是第7页，共63页噬菌体侵染细菌现在学习的是第8页，共63页噬菌体侵染细菌噬菌体侵染细菌 仍有少量phage (K) 可在 E. coli B 中生存，是因为E.coli B phage 对 (K) 进行了修饰。大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phage (B)修饰的phage (K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修饰作用）现在学习的是第9页，共63页R-M 系统系统 细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制的限制修饰系统修饰系统 (R-M

6、 Restriction-modification system)。 R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。细菌系统是细菌安内御外的积极措施。细菌 R-M 系统的限制酶系统的限制酶可以降解可以降解 DNA，为避免自身，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身化酶）自身 DNA，未被修饰的外来，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。现在学习的是第10页，共63页l 限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切

7、酶的发现l1968 Linn 和 Arber 从 E.coli B 中发现限制酶 l1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶 l1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans 因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 l限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链 DNA 分分子中的特定核苷酸序列，并对子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割的一种酶。分子进行切割的一种酶。 l功能：降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。现在学习的是第11页，共63页EcoR IEscherichia属名

8、属名Coli种名种名Ry13株系株系编号编号 若种名头若种名头2 2个字母相同则其中一个可用种名的第一和个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。第三个字母。 限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名现在学习的是第12页，共63页限制性核酸内切酶的活性单位限制性核酸内切酶的活性单位 50L Buffer 50L Buffer 中，含中，含1g 1g 底物底物 DNADNA，于最，于最适反适反应条件和温度下，保温应条件和温度下，保温 1 1 小时，能使小时，能使 1g 1g DNA DNA 完全完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用用 U U 表示。

9、表示。 buffer buffer （pH=8.0pH=8.0） ： 50 mmol/L Tris-HCl 10 mmol/L MgCl50 mmol/L Tris-HCl 10 mmol/L MgCl2 2 1 mmol/L DTT1 mmol/L DTT或巯基乙醇或巯基乙醇 100g BSA/ml 100g BSA/ml （DDTDDT：二硫苏糖醇：二硫苏糖醇 BSABSA：牛血清蛋白：牛血清蛋白) ) 现在学习的是第13页，共63页限制性核酸内切酶的切割特点限制性核酸内切酶的切割特点l在在 DNA 分子双链的特异性识别序列部位，切割分子双链的特异性识别序列部位，切割 DNA 分子，产生链

10、的断裂。分子，产生链的断裂。 l2 个单链断裂部位在个单链断裂部位在 DNA 分子上的分布，通分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的常不是彼此直接相对。断裂结果形成的 DNA 片片段，具有互补的单链延伸末端。段，具有互补的单链延伸末端。现在学习的是第14页，共63页识别序列识别序列l 绝大多数的绝大多数的型限制性核酸内切酶都能够识别由型限制性核酸内切酶都能够识别由4-84-8个核苷个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割序列内切割DNADNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切分子的，因此这些识别序

11、列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。酶的切割位点或靶序列。 l 识别识别序列有序列有连续连续的（如的（如GATC）和）和间间断的断的 (如如 GANTC)两两种，它种，它们们都呈回文都呈回文结结构。构。A B C C B A A B C C B AA B N B AA B N B A A B B A A B B A 或或现在学习的是第15页，共63页EcoR 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 不同核酸内切酶的特异识别位点Pst5 C T G C A G3 3 G A C G T C .5 现在学习的是第16页，共63页A A G C T TT T C G A A

12、A A G C T TT T C G A A ABCDDNADNAHindHind切割位点核酸内切酶核酸内切酶Hind对双链对双链DNADNA分子的切割作用分子的切割作用现在学习的是第17页，共63页三、种酶切末端三、种酶切末端l 平齐末端（如平齐末端（如 Sma、Alu、Hae） 5-GG CC-3 3-CC GG-5 5-GG- -CC-3 3-CC- -GG-5 5粘性末端（如粘性末端（如 EcoR ） 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 5-G- -AATTC-3 3-CTTAA- -G-5 3粘性末端（如粘性末端（如 Pst ）现在学习的是第18页，共63页同裂酶和同尾酶同裂

13、酶和同尾酶l 同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。列。产生同样的切割，形成同样的末端。 如：如：Hpa和和 Msp均可切割均可切割 C CGG。 当胞嘧啶甲基化后，当胞嘧啶甲基化后， Msp不能再切割。不能再切割。 l同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后但切割后 DNA 分子产生的粘性末端相同的限制性核分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。酸内切酶。现在学习的是第19页，共63页5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 BamH5-TGA

14、TCA-3 3-ACTAGT-5 Bcl5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 BglBamH Bcl Bgl三种酶可产生相三种酶可产生相同的同的 5GATC 粘性末端，由这种同尾粘性末端，由这种同尾酶产生的酶产生的 DNA 片段可因粘性末端的互片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。补而彼此再连接起来。现在学习的是第20页，共63页限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 1. 底物底物 DNA （1）DNA 纯度: RNA 与 E 结合影响有效酶浓度； （2）DNA 浓度: DNA 过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 如：4g DNA /1U HPa 50l 37 15h 1g

15、 DNA /1U HPa 50l 37 1h 现在学习的是第21页，共63页（3）识别位点及邻近位点特异性序列 如：pBR322 DNA 有 4个 Nar切点 (GGCGCC)其中 2 个切点用1U 酶水解 1h 完全切开, 2 个切点用50U 酶水解 16h 水解不完全。 Xma 切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割。 （4）DNA 二级/三级结构 如：超螺旋如：超螺旋 DNA (病毒或质粒病毒或质粒) 比线状比线状 DNA 需酶多需酶多 （5）提取时混入杂质可改变识别特异性 如： 高浓度 Hg2+、酚、 氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl 等。现在学习的是第22页，共6

16、3页 2.反应系统因素反应系统因素 （1）缓冲液（无菌、无污染） （2）金属离子 如：如：型酶需型酶需 Mg2+，若以，若以 Mn2+ 代替代替Mg2+（如（如Hind，EcoRI）则特异性改变。）则特异性改变。 离子浓度不合适会抑制酶活。离子浓度不合适会抑制酶活。 （3）牛血清蛋白 (BSA) BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量。过量 BSA 会引起电泳拖尾会引起电泳拖尾。限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件现在学习的是第23页，共63页3. 星活性星活性 限制性内切酶识别特异性放宽。限制性内切酶

17、识别特异性放宽。 EcoR在正常情况下识别在正常情况下识别 GAATTC 序列发生切割，但如果序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过缓冲液中甘油浓度超过 5%，其识别位点发生松动，可在，其识别位点发生松动，可在 AATT 处处发生切割，发生切割，EcoR这种特殊的识别能力叫做星活性，用这种特殊的识别能力叫做星活性，用 EcoR*表示表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。 影响因素影响因素：甘油浓度：甘油浓度 12-20%，酶与，酶与 DNA 比例，离子强度，比例，离子强度，45% 聚乙二醇聚乙二醇 (PEG)，有机溶剂，有机溶剂，8% 二甲

18、基亚枫，二价阳离子，二甲基亚枫，二价阳离子，12% 乙乙醇。醇。 限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件现在学习的是第24页，共63页l重组重组DNADNA前的切割前的切割 l构建新质粒构建新质粒 l构建物理图谱构建物理图谱 lDNA分子杂交分子杂交 l用限制性内切酶消化受体用限制性内切酶消化受体DNA l制备制备DNA探针探针 l亚克隆以用作序列分析亚克隆以用作序列分析 l基因定位，基因定位，DNA同源性研究同源性研究 限制性核酸内切酶的应用限制性核酸内切酶的应用现在学习的是第25页，共63页l重组重组DNADNA前的切割前的切割 l构建新质粒构建新质粒 l构建物理图谱构建物理

19、图谱 lDNA分子杂交分子杂交 l用限制性内切酶消化受体用限制性内切酶消化受体DNA l制备制备DNA探针探针 l亚克隆以用作序列分析亚克隆以用作序列分析 l基因定位，基因定位，DNA同源性研究同源性研究 限制性核酸内切酶的应用限制性核酸内切酶的应用现在学习的是第26页，共63页l 甲基化酶分两类：甲基化酶分两类： l维持性甲基化酶：用于在新合成的维持性甲基化酶：用于在新合成的 DNA 链上进行甲基化的酶。甲链上进行甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。基化位置与模板链上的相同。 l构建性甲基化酶：用于在非甲基化的构建性甲基化酶：用于在非甲基化的 DNA 链上进行甲基化的酶。链上进行甲基化的

20、酶。 l 用甲基化酶进行甲基化的作用用甲基化酶进行甲基化的作用 l封闭封闭 DNA 链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。 l构建新的酶切位点构建新的酶切位点现在学习的是第27页，共63页DNA连接酶（连接酶（ligase）l 能够催化 DNA 中相邻的 3-羟基和 5-磷酸基末端之间形成3，5-磷酸二酯键; lT4DNA 连接酶 可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可使平端的双链 DNA 分子相互连接。 l大肠杆菌 DNA 连接酶 只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子.现在学习的是第28页，共63页ds-DNA结构结构: 切口切口,

21、缺口缺口, 断口断口缺口缺口(gap) 切口切口(nick) 断口断口(cut)3HO P53HO P5现在学习的是第29页，共63页AATTC GG CTTAAAATTC GG CTTAA5 555(1) (2)AATTC GG CTTAAAATTC G G CTTAA55AATTC GG CTTAA5 5(a)分子间连接(b)分子内连接(1) (2)ATGCTATAGCTAT4连接酶T4连接酶现在学习的是第30页，共63页一一. DNA的连接方法的连接方法 两种不同的两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用而方法的选用则是根据其两者

22、末端的则是根据其两者末端的DNA结构结构. 1. 直接连结法直接连结法-该法适用于该法适用于: 1) 同种限制酶作用不同同种限制酶作用不同DNA片段产生的片段产生的相同粘性末端相同粘性末端 重组重组DNA可用同种酶再切开可用同种酶再切开 2) 不同种限制酶作用不同不同种限制酶作用不同DNA片段产生的片段产生的相容性末端相容性末端 i.重组重组DNA分子不能再为这两种酶所作用分子不能再为这两种酶所作用,如如:BamHI/BglII ii.重组重组DNA分子可为其中一种酶所作用分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用的可能但为另一种酶作用的可能性较小性较小,如如MboI/BamHI 3) PCR

23、产物与特定载体的连接产物与特定载体的连接 4) 限制酶和其他方式产生的限制酶和其他方式产生的平末端平末端.现在学习的是第31页，共63页2.人工接头连接法人工接头连接法1) 人工接头（人工接头（linker）的结构）的结构 i. 中轴对称互补中轴对称互补,可自行退火形成双链可自行退火形成双链.如如: 5-CCGGAATTCCGG- 3 3-GGCCTTAAGGCC-5 ii. 至少有一特定的限制酶识别位点至少有一特定的限制酶识别位点 iii. 某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相.如如: 八聚体八聚体 d(GGAATTCC

24、) 十聚体十聚体 d(CGGAATTCCG) 十二聚体十二聚体 d(CCGGAATTCCGG)2) 用途用途 i. 平整末端的连接平整末端的连接(各种结构的各种结构的DNA末端均可经过修饰变成平整末末端均可经过修饰变成平整末端端) 2 X 5-CCGGAATTCCGG-3退火退火现在学习的是第32页，共63页 ii. 产生新的克隆位点产生新的克隆位点 iii. 合成匹配接头合成匹配接头3) 连接方法连接方法 人工接头磷酸化人工接头磷酸化 退火形成双链退火形成双链 与目的与目的DNA相连相连 限制限制 酶切酶切 两两DNA分子相连分子相连4) 适用范围适用范围 人工接头连接法适合于那些只有一种人

25、工接头连接法适合于那些只有一种DNADNA片段需加人工接头就可片段需加人工接头就可以与另一以与另一DNADNA分子相连的分子相连的DNADNA分子分子. .利用人工接头也可使任意两个平端的利用人工接头也可使任意两个平端的DNADNA分子相连分子相连. .这种直接相连的办法简便这种直接相连的办法简便, ,快速快速, ,但最后连接起来的但最后连接起来的DNADNA可可能具有不同的结构能具有不同的结构. .为避免这些结构的产生为避免这些结构的产生, ,可先使一种可先使一种DNADNA先加上人工先加上人工接头后接头后, ,再与另一种再与另一种DNADNA分子相连分子相连. .现在学习的是第33页，共6

26、3页3. 匹配接头连接法匹配接头连接法人工接头虽然可连接两个具不同末端的人工接头虽然可连接两个具不同末端的DNA分子分子,但这些末端在加入人工接但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端头前必须变为平整末端.然而然而,有时实验不容许使用人工接头或使用人工接有时实验不容许使用人工接头或使用人工接头不方便头不方便,此时此时,便可使用匹配接头便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不同末端的它可用于直接连接各种具不同末端的DNA分子分子:i. 平端平端 + 突起末端突起末端(5-突起突起, 3-突起突起)ii.粘性末端粘性末端 (5-突起突起 + 5-突起突起: EcoRI+HindIII 5-突起

27、突起 + 3-突起突起: EcoRI+PstI 3-突起突起 + 3-突起突起: PstI+SacI)1) 匹配接头的结构特点匹配接头的结构特点 i. 由两个低聚核苷酸组成由两个低聚核苷酸组成 ii. 部分区域可以互补部分区域可以互补 iii. 退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端2) 匹配接头的种类匹配接头的种类现在学习的是第34页，共63页 i. 预制匹配接头预制匹配接头(连接平端和粘性末端连接平端和粘性末端) 人工接头人工接头 + 匹配接头匹配接头 预制匹配接头预制匹配接头 ii. 转换匹配接头转换匹配接头(连接连接5-突起和突起和3-

28、突起末端突起末端) 二匹配接头退火二匹配接头退火 转换匹配接头转换匹配接头 二人工接头二人工接头 连接酶连接酶 双酶切双酶切 转换匹配接头转换匹配接头 iii. 单链匹配接头单链匹配接头(连接连接5-突起和突起和3-突起末端突起末端)4. 同聚物加尾连接法同聚物加尾连接法 在两个不同的在两个不同的DNA分子末端各加上一个可互补的同聚物分子末端各加上一个可互补的同聚物,即即AT或或GC.5. 连接方法的选择连接方法的选择 方法选择的依据方法选择的依据: 1) 两两DNA分子的末端结构分子的末端结构 2) DNA 分子的限制酶谱分子的限制酶谱 3) 是否需要回收是否需要回收DNA片段片段现在学习的

29、是第35页，共63页连接方式的选择连接方式的选择载体末端载体末端 外源外源DNA末端末端 常规连接常规连接 脱磷酸化脱磷酸化 同聚物同聚物 平端连接平端连接 补齐补齐,人工接头人工接头 结构结构 结构结构 载体载体 加尾加尾 外切酶外切酶 5-突起突起 相容相容5-突起突起 第二选择第二选择 第一选择第一选择 不能不能 不能不能 不能不能 5-突起突起 非相容非相容5-突起突起 不能不能 结合使用接头结合使用接头 不能不能 不能不能 第一选择第一选择 3-突起突起 相容相容3-突起突起 唯一选择唯一选择 不能不能 不能不能 不能不能 不能不能 3-突起突起 非相容非相容3-突起突起 不能不能

30、不能不能 第一选择第一选择 不能不能 第二选择第二选择 或平端或平端 3-突起突起 5-端突起端突起 不能不能 不能不能 第一选择第一选择 不能不能 第二选择第二选择 (补齐后补齐后) 平端平端 平端平端 不能不能 可能可能 可能可能 第一选择第一选择 可能可能 平端平端 3-或或5-突起突起 不能不能 不能不能 第一选择第一选择 不能不能 第二选择第二选择现在学习的是第36页，共63页二二. DNA的连接反应的连接反应 1. 连接反应理论连接反应理论 当两种当两种DNA分子相连时分子相连时,它们可能产生不同的结果它们可能产生不同的结果,这些结果与以这些结果与以下因素有关下因素有关: 1) 连

31、接反应系统中的总连接反应系统中的总DNA浓度浓度i 2) 一个一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效浓度分子靠近同一分子另一端的有效浓度j, 该值与该值与DNA的的长度成反比长度成反比,即即DNA分子越大分子越大,该分子的两末端越不易相互作用该分子的两末端越不易相互作用(即自身环化即自身环化) 3) 两种不同两种不同DNA分子的克分子浓度之比值分子的克分子浓度之比值. 2. 连接反应条件连接反应条件 1) 评估连接反应结果的方法评估连接反应结果的方法 i. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 ii.大肠杆菌转化大肠杆菌转化 2) 反应条件反应条件现在学习的是第37页，共63页 i. 温度温度 ii.

32、 ATP浓度浓度 iii. 时间时间 iv. 连接酶浓度连接酶浓度 v.克分子比率克分子比率现在学习的是第38页，共63页DNA 聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）DNA 聚合酶 指在 DNA (或 RNA) 模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物 3 OH 末端聚合DNA 链的一类酶。 DNA 聚合酶在 DNA复制时起关键作用。 DNA 聚合酶主要有三类：聚合酶（pol），聚合酶(pol) ，聚合酶(pol)。其中聚合酶参与 DNA 修复，聚合酶参与 DNA 复制。聚合酶是基因工程中的常用酶。 现在学习的是第39页，共63页DNA 聚合酶聚合酶和和 的的比较比

33、较现在学习的是第40页，共63页DNA 聚合酶聚合酶的的特点：特点： 需模板需模板 (DNA 或或 RNA)； 需引物；需引物； 具有三种酶活性，即具有三种酶活性，即 53聚合酶活性；聚合酶活性；53外切酶活性和外切酶活性和 35外切外切酶活性。外切外切酶活性。DNA 聚合酶（聚合酶（DNApolymerase）现在学习的是第41页，共63页DNA聚合酶在 DNA 复制过程中的作用现在学习的是第42页，共63页1、 53聚合酶活性：聚合酶活性： CCG GGCTATCGGE.coli DNApolIMg 2+，4dNTPCCGATAGCC GGCTATCGG2、53外切酶活性外切酶活性 3、3

34、5外切酶活性外切酶活性 GATAGCC AGCTATCGGTCGATAGCC AGCTATCGGE.coli DNApolIMg 2+ pC，pT5TCGATAGCC AGCTATE.coli DNApolIMg 2+TCGATA AGCTAT+ pC，pG，pC5DNA 聚合酶的三种活性聚合酶的三种活性现在学习的是第43页，共63页DNA DNA 的切口平移（的切口平移（nick translationnick translation） DNA 聚合酶聚合酶在分子克隆中的主要用途是通过在分子克隆中的主要用途是通过 DNA 缺口缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的平移，制备供核酸分子

35、杂交用的带放射性标记的 DNA 探针。此时，探针。此时， DNA 聚合酶聚合酶的的 5- 3核酸外切酶活性和核酸外切酶活性和 5-3 聚合酶活性同时发生聚合酶活性同时发生。5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 3 5 5-3外切酶活性5-3聚合酶活性5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 3 5 未经标记的核苷酸经标记的核苷酸现在学习的是第44页，共63页DNA DNA 杂交探针的制备杂交探针的制备5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 * * * *(a)(b)(c)(d)(e)(a) 双链的DNA分子(b) 带有3-OH末端的单链缺口(c) pol

36、从5-P移去一个核苷酸(d) pol将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸(e) 重复(c)(d)的步骤，缺口沿5-3方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链现在学习的是第45页，共63页探针（probe）l 探针：用来探知被测物存在的小 DNA 或RNA叫做探针。 l 标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。 l 分子杂交：探针 DNA 或 RNA 与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecular hybridization）现在学习的是第46页，共63页DNA聚合酶l 来源 E.coli，由染色体 DNA 基因编码。商品上用的此酶来源于 Phage NM964 整合的溶

37、源性 E.coli。 l 结构 一条多肽链，MW = 109，000 D。 l 活性 5 3聚合，3 5和 53外切。现在学习的是第47页，共63页Klenowl 来源： E.coli DNA Polymerase经蛋白酶水解的大片段 (Klenow 和 Henningseon.1970DNApol枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶C 端端 (76kd) + N 端（端（36kd） Klenow 5 3聚合 3 5外切 5 3外切 现在学习的是第48页，共63页Klenowl 用途 填补限制酶的 5-粘性末端为平齐末端 5CC 3GGAATT5CCTTAA3 3GGAATT5 Klenow3-末端标记

38、Klenow 在无底物时只进行 3 5外切；有底物存在时则聚合。 这种标记也称作交换标记，但 Klenow 作用不如T4DNA聚合酶。现在学习的是第49页，共63页T4DNA 聚合酶l 来源：T4Phage 感染的 E.coli l 结构：MW=114,000 d l 活性： 53聚合活性； 35外切活性，对单链活性大于双链DNA，外切酶活性比 Klenow 大 200 倍 l 用途 l填补或标记限制酶切后产生的 5- 粘性末端的3-凹缺末端。（同 Klenow） 3- 粘性末端的标记制备 DNA探针,同 Klenow 末端标记。 现在学习的是第50页，共63页T7DNA聚合酶（测序酶）l 来

39、源：T7 Phage 感染的 E.coli l 结构：由 2 个蛋白亚基组成： T7 phage gene 5 蛋白 + 宿主硫氧蛋白 l 活性： l 53聚合，持续反应时间最长，所以合成的 DNA 链长。故在 DNA 测序中很优越。 35外切，是 DNA 聚合酶的 1000倍。现在学习的是第51页，共63页l 用途用途 l 复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列 l用填补或交换反应快速进行末端标记。 l l与 TDNApol一样，平齐粘性末端。 定点突变中互补链的合成。553 3 3355现在学习的是第52页，共63页修饰的 T7DNA 聚合酶(测序酶)l 来源： 天然 TDNA 聚合酶经

40、修饰处理 l 结构： 同T聚合酶。 用还原剂、分子氧、低浓度 Fe+与酶保温几天，可使Phage T7 gene5 蛋白 N- 端35外切酶活性中心失活 (O- 修饰)。 即：53聚合酶作用提高，持续性长。3 5外切作用下降 99% 以上。 现在学习的是第53页，共63页Taq DNA 聚合酶(Thermusaqraticus)l 来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种 l 结构：单亚基 MW = 94,000 d。 l 活性：聚合最适温度为 75-80，不具35外切酶活性，具53外切活性 。 l 用途： lPCR 反应。 l测序，高温下进行 DNA 合成可减少模板二级结构。现在学习的是第

41、54页，共63页末端转移酶末端转移酶 ( (不依赖模板的不依赖模板的 DNA DNA 聚合酶聚合酶) )l 来源来源：只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见：只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的的 DNA 聚合酶聚合酶 (Chang 和和Bollum,1986)。 l 结构结构 ：MW = 60,000 d. l 活性活性：催化催化 dNTP 掺入掺入 DNA 3-OH 末端，形成同聚物末末端，形成同聚物末端；反应不需模板端；反应不需模板 DNA，需，需 Co2+ l 用途用途： l 克隆克隆DNA片段时加上互补片段时加上互补同聚物末端同聚物末端，便于与载体连接。，便于

42、与载体连接。 l 末端标记末端标记现在学习的是第55页，共63页反转录酶反转录酶(reverse transcriptase)(reverse transcriptase) l 来源：商品反转录酶有两种来源：商品反转录酶有两种 l 来自禽类成髓细胞瘤病毒来自禽类成髓细胞瘤病毒 (AMV)。 l 来自能表达来自能表达 Moloney 鼠白血病毒鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因反转录酶基因的的 E.coli。 l 结构和活性：结构和活性：+84，000M-MLV+62，000 94，000 AMVRNAseH5-3聚合活性肽链酶类别现在学习的是第56页，共63页l 用途： 对 RNA:DNA

43、杂交体中的 RNA 特异性地降解，免除了在反转录完成后再用 NaOH 降解 RNA 模板的步骤。现在学习的是第57页，共63页l 来源来源 l T7、T3RNA 聚合酶在聚合酶在 E.coli （或细菌）中的克隆表达。（或细菌）中的克隆表达。 l E.coli RNA 聚合酶。聚合酶。 l 活性：在活性：在 DNA 指导下合成指导下合成 RNA，结合于启动子部位，转录，结合于启动子部位，转录无意义链无意义链 (一一) 产生与有意义链相似产生与有意义链相似 (以以U代替模板中代替模板中 T) 的链的链。 转录链为无意义链，负链转录链为无意义链，负链 (-)。 不转录链为有意义链，正链不转录链为有

44、意义链，正链 (+)。RNA 聚合酶（聚合酶（RNApolymerase）现在学习的是第58页，共63页l 磷酸激酶催化 5-OH 加 P （标记） l 和磷酸酶去除 5- P （防止自身环化） PNKasePMase 5HO A T T A G C C C G 5HO A T T A G C C C G T A A T C G G G C OH 5 T A A T C G G G C OH 5多核苷酸激酶多核苷酸激酶磷酸甲酯酶磷酸甲酯酶 Phosphomonoesterase 5p A T T A G C C C G 5p A T T A G C C C G T A A T C G G G

45、C p 5 T A A T C G G G C p 5磷酸激酶和磷酸酶磷酸激酶和磷酸酶现在学习的是第59页，共63页核酸酶（核酸酶（nucleasenuclease）l Bal13 核酸酶 l 从 DNA 末端同时降解两条链。 l 用于基因表达调控序列的研究。 l S1 核酸酶 l 降解单链核酸。 用于把具粘性末端的 DNA 变为平齐末端 的 DNA。 在 DNA 部分变性条件下，能在富含 AT 区切断 DNA。现在学习的是第60页，共63页核酶（核酶（ribozyme）l 具有酶活性的具有酶活性的 RNA片段。片段。 l 是真核生物转录产物地内含子本身含有的前是真核生物转录产物地内含子本身含有的前导序列，能在离体条件下特异地催化内含子剪导序列，能在离体条件下特异地催化内含子剪切。切。 l 1981 Cech 和和 Altman 首次发现，并因此获首次发现，并因此获得得1989年的诺贝尔奖。年的诺贝尔奖。 l 核酶可以作为核酶可以作为 RNA 的限制性内切酶用于基因的限制性内切酶用于基因操作。操作。现在学习的是第61页，共63页现在学习的是第62页，共63页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第63页，共63页