植物生理学实验-7.docx

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1、刖产/步本科实验报告姓名：钱嘉曙 学院：环境与资源学院 专业：农业资源与环境 学号：3180100470指导教师：周启发老师2019年 12月4日刖户/货实验报告课程名称： 植物生理学及实验 实验类型:探索、综合或验证实验工程名称：植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定学生姓名：钱嘉曙专业:农业资源与环境 学号:3180100470同组学生姓名：林姝指导老师：周启发老师实验地点：生物学实验中心313琴 实验日期：2019年H月27日，12月4日订 线一、实验目的和要求1 .掌握植物组织中蛋白和丙二醛(MDA, malonyldialdehyde) 提取。2 .掌握用比色法测定组织粗提液蛋白质和MD

2、A.3 .掌握植物组织中超氧物岐化酶(SOD)活性测定方法；. 了解植物衰老的原理。二、实验内容和原理衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能自然衰退，最终 导致死亡的过程。衰老时生理生化变化主要有：蛋白质含量下 降，生物膜降解，核酸含量的变化，光合速率下降，呼吸速率 下降，植物内源激素的变化等。植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白 质含量减少(可溶性蛋白)。自由基代谢失调，并在体内积累膜 脂过氧化的产物之一：MDAo(1)可溶性蛋白测定的原理考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生 变化，从465nm偏转到595nm,并表现出在595nm处的吸 收值与溶液中的蛋白质含

3、量有线性关系，其范围从 01000g/mlo据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白 为常用的标准蛋白。待测样品经缓冲液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋 白质提取液与考马斯亮蓝G-250反响呈蓝色。测定595nm 吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋 白的含量。(2) MDA测定原理MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反响，形成 粉红色复合物(3, 5, 5三甲基嗯嗖2, 4-二酮)，该复合 物在532nm处有最大吸收峰；600nm处是最小吸收峰，两 峰差值的消光系数为155 (mM)H cm1(3)超氧物岐化酶(SOD)活性测定原理： _SOD2。2 + 2H2。“

4、Hz。? +。2四氮嗖蓝(NBT)光照还原的分光光度法:核黄素受光照产生 的能将NBT还原为蓝色的甲腺，甲腺在560nm波长有最 大吸收，而SOD能清除。2一,抑制甲腺的产生使吸收减小。 通过分光光度检测SOD对-的抑制率，可以表征出SOD含 量。三、主要仪器设备准备材料：叶龄差异明显的叶片假设干仪器：离心机、天平、制冰机、分光光度计，研钵、移液枪、移 液管、离心管等。四、操作方法与实验步骤 (一)可溶性蛋白测定(1)制备蛋白提取液称叶龄差异明显的叶片各0.50g，加入5nli磷酸缓冲液(50mmol, pH值为7. 8),于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g离心力作用下(4) 离心lOmin

5、,其上清液即为蛋白提取液。(2) 0 - lOOug/ml蛋白标准曲线的制作(3)显色反响(样品的测定)：取40ul蛋白提取液+160U 1磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入 4. 8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min,用lOnrni厚的比色杯在595nm下比色读取0D值。对照为空白的磷酸缓冲液加上4. 8ml考马 斯亮蓝溶液。（二）MDA测定取上清液1.0ml于7ml离心管中，加TBA与TCA混合液4.0ml,然 后在离心管盖上戳一小孔，92C水浴保温30min空白管：1mL Pi-buffer +TBA 与 TCA 混合液 4. 0ml （92 水浴30min）冷却后，平衡，离心5min；

6、lOOOOrpm测定 A532, A450 和 A600。（三）超氧物岐化酶（SOD）活性测定称叶龄差异明显的叶片各0.5g，加入5ml磷酸缓冲液（50nimol, pH值为7.8）,于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g离心力作用下 （4）离心10min,其上清液即为酶提取液。在暗光条件下加入3mL NBT反响液 和100 D L酶提取液于试管中， 25照光（4000T00001ux）并计时,6-25min后出现颜色变化，9min 后测560nll10D值。同时作空白实验。根据SOD抑制NBT光化学还原的量计算SOD酶活性（unit/gFW）。 一个酶活单位相当于引起31nL NBT反响液到

7、达50%抑制所需要的酶 量。测定时用未照光NBT反响液调零。五、实验数据记录和处理（一）可溶性蛋白测定标准曲线：y = 164. 08x - 3. 6176R2 = 0. 9956值OD)螂和 VSCQ显色反响:叶片种类0D值新叶 0. 823老叶0. 152新叶蛋白质量：y = 164. 08 * 0. 823 - 3.6176 =131. 420 ug老叶蛋白质量：y = 164. 08 * 0. 152 - 3.6176 =21.322 ug在标准曲线上查得新叶蛋白质量为131. 420 ug,老叶为21.322 ug可溶性蛋白含量（Ug/g.FW）=标准曲线上查得的蛋白质量（Ug ）

8、X提取液 体积/ （测定加样量*鲜重）新叶可溶性蛋白含量=131. 420 u g *5ml/ （40*10-3ml*0. 50g） =32855 u g/g. FW老叶可溶性蛋白含量二2L 322 u g *5ml/（40*10-3 ml*0. 50g）=5330. 6 u g/g. FW（二）MDA测定叶片在532nm下在450nm下在600nm下新叶0. 0830. 1690. 020老叶0.2121. 3650. 053M.%含 /为比色杯厚度由求得新叶 MDA (mM) = (0. 083-0.020) /155/1=4. 065*W4 (mM) 老叶 MDA (mM) = (0.2

9、12-0. 053) /155/1=1. 026*10-3 (mM)蔗糖对MBA-TBA反响有干扰，可用下式消除：二 6.45(A -A )-O.56A 532600450求得新叶 MDA(M)=6. 45 (0. 083-0. 020) -0. 56*0. 169=0. 3117 (M) 老叶 MDA(M)=6.45 (0.212-0. 053) -0. 56*1. 365=0. 2612(pM)(三)(三)超氧化物歧化酶（SOD）活性测定SOD活力单位组别OD 560nm新叶0.514老叶0.912对照组1.288gFW（对照管OD值-测定管OD值） 对照管OD值*0.5新叶：(1.288

10、-0.514) / (1.288*0.5) =1.2019 (unit/gFW)老叶:(1. 223-0. 893) / (1.288*0.5) =0. 5124 (unit/gFW)六、实验结果与分析（-）可溶性蛋白测定新叶=32855 u g/g. FW 老叶=5330. 6 u g/g. FW说明在叶片衰老的过程中，可溶性蛋白的含量减少。（二）MDA测定排除蔗糖干扰，叶片衰老过程中MDA的含量在增加。（三）超氧化物歧化酶（SOD）活性测定高等植物叶片中SOD活性随衰老而下降七、讨论、心得.比拟新老叶片可溶性蛋白和MDA的差异。新叶可溶性蛋白较老叶多，而老叶中MDA的含量在增加。叶片在衰老

11、过程中，可溶性蛋白减少，丙二醛含量增加。1 .植物组织中哪些物质对可溶性蛋白和丙二醛测定（TBA法）干扰较大？丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂 质发生过氧化反响而产生的，故而它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用TBA在酸性条件下加热与MDA反响，生 成红棕色的三甲川，三甲川的最大吸收波长在532nnio由于植物遭受干旱、高温、 低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，而且糖与TBA显色反响产物的最大吸收波长在 450nm处，在532nm处也有吸收，因此测定植物组织中MDA与TBA反响产物含量 时一定要排除可溶性糖以及催化产生可溶性

12、糖的酶的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。2 .丙二醛测要第二次离心？可溶性蛋白可以在比色前第二次离心吗？3 . 1测定丙二醛时，加入TBA溶液摇匀，又经过沸水浴加热，所以上清液中已混 有不少杂质，需再次离心去除TBA与丙二醛显色反响过程中产生的不溶性物质。 3.2离心的原理是：由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同， 在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同。离心的目的是相互间的别离。可溶性蛋白在加入考马斯亮蓝之后，需“混匀后放置2min，其原因是：蛋 白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间到达平衡。而考马斯亮蓝G- 250和蛋白质

13、是通过范德华力结合的，我猜想，假设再二次离心，范德华力有可能 缺乏以抵抗离心过程中的离心力，从而失去实验效果。4 .可溶性蛋白和MDA两个指标也常作为植物逆境受害的指标？可溶性蛋白和MDA常作为植物逆境受害的指标。一般植物在逆境条件下，如高温，盐碱，以及强光等逆境条件下会产生 膜质过氧化。而丙二醛含量是植物细胞膜质过氧化程度的表达，丙二醛含量 高，说明植物细胞膜质过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重。可溶性蛋白指可以以小分子状态溶于水或其他溶剂的蛋白，它是重要的 渗透调节物质和营养物质。而植物在水分胁迫下，可溶性蛋白会局部转化为 氨基酸，从而增加渗透性物质。比方随着干旱胁迫的加重，可溶性蛋白随着 水分胁迫的加强会呈现出降低的趋势，在低温下，可溶性蛋白也会逐渐降低。 (不考虑长时间后植物不断失水组织内蛋白质含量突然增高的情况)1祁伟亮，冯鸿，刘松青，陈洁，龚壁燃，夏杰，张莉，任迎虹.不同桑品种在干旱胁迫下脯氨酸及可溶性蛋白质含量 的变化规律研究中中国野生植物资源,2017,36(05):34-36+39.2文U明池.黄瓜幼苗在低温下相对电导率、SOD及可溶蛋白含量的变化同华北农学报,1992(02):118-119.