医学免疫学免疫学检测技术.ppt

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1、医学免疫学免疫学检测技术现在学习的是第1页，共26页第一节第一节 抗原或抗体检测抗原或抗体检测I. Detection of antigens or antibodies现在学习的是第2页，共26页一、抗原一、抗原-抗体反应的特点抗体反应的特点Specificity（一）高度特异性（一）高度特异性 Cross-reaction: common antigen 交叉反应：共同抗原交叉反应：共同抗原 Antiserum absorption 抗血清吸收抗血清吸收 1st antibody & 2nd antibody 一抗；二抗一抗；二抗现在学习的是第3页，共26页Reversibility/in

2、vertibility: （二）可逆性（二）可逆性 non-covalent, surface-binding , dissociable 非共价、表面结合，可解离非共价、表面结合，可解离 complementary capacity: affinity; avidity 互补程度：亲和力互补程度：亲和力 ； 亲合力亲合力现在学习的是第4页，共26页Visibility（三）可见性的条件（三）可见性的条件Compatible concentrations of antigen and antibody combined in proportion at or near equivalence

3、Antigen: multivalent; Antibody(IgG): divalent 比例适合：抗原多价，抗体比例适合：抗原多价，抗体2价。交织成网。价。交织成网。Ph value; Temperature; Ionic concentration 条件适宜：酸碱度、温度、离子浓度条件适宜：酸碱度、温度、离子浓度Adequate concentration, binding strength; reaction time 足够浓度、结合强度和反应时间足够浓度、结合强度和反应时间现在学习的是第5页，共26页Prozone phenomenon前带现象前带现象现在学习的是第6页，共26页二、

4、抗原二、抗原-抗体反应的应用抗体反应的应用Terms 术语术语Serological reaction 血清学反应血清学反应Qualitative analysis 定性定性Quantitation 定量定量Orientation 定位定位Titration 滴定滴定Titer 效价效价/滴度滴度现在学习的是第7页，共26页三、常用的抗原三、常用的抗原-抗体反应技术抗体反应技术经典技术经典技术中和反应中和反应补体结合反应补体结合反应凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应现在学习的是第8页，共26页I ) Agglutination（一）凝集反应：（一）凝集反应：颗粒性抗原颗粒性抗原或或包被有可溶性抗

5、原的颗粒包被有可溶性抗原的颗粒 + 相应抗体相应抗体肉眼可见的凝集块肉眼可见的凝集块 1. 直接凝集直接凝集 颗粒性抗原颗粒性抗原+ 相应抗体相应抗体 玻片凝集：抗原定性玻片凝集：抗原定性 （ABO血型血型） 试管凝集：抗体定量试管凝集：抗体定量 （肥达反应）（肥达反应） 2. 间接凝集间接凝集 包被有可溶性抗原的颗粒包被有可溶性抗原的颗粒 + 相应抗体相应抗体 红细胞（间接血凝）；乳胶（间接乳凝）红细胞（间接血凝）；乳胶（间接乳凝） Coombs Test: 红细胞（红细胞（Rh抗原）抗原）+ 不完全抗体不完全抗体 + 抗人球蛋白抗人球蛋白 3. 派生的试验派生的试验 反向间接凝集反应：包被

6、抗体的颗粒反向间接凝集反应：包被抗体的颗粒 + 抗原抗原 间接凝集抑制反应：间接凝集抑制反应： （乳胶妊娠试验乳胶妊娠试验） 抗体抗体 + 未知抗原未知抗原 + 包被有相应可溶性抗原的颗粒包被有相应可溶性抗原的颗粒 凝集？凝集？现在学习的是第9页，共26页Haemagglutination现在学习的是第10页，共26页II ) Precipitation （二）沉淀反应（二）沉淀反应 可溶性抗原可溶性抗原 + 相应抗体相应抗体肉眼可见的沉淀物肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为使用半固体琼脂凝胶为介质介质琼脂扩散琼脂扩散/免疫扩散免疫扩散1. 单向免疫扩散：抗原单向免疫扩散：抗原 的的定量（

7、定量（Ig、C3 ）2. 双向免疫扩散：抗原双向免疫扩散：抗原/抗体的抗体的定性、组成及定性、组成及Ag相关性分析相关性分析3. 免疫电泳：免疫电泳： 电泳电泳 + 双向免疫扩散双向免疫扩散 （抗原分析）（抗原分析）4. 对流电泳：对流电泳： 双向免疫扩散双向免疫扩散 + 电泳电泳 （抗原（抗原/抗体定性）抗体定性）5. 火箭电泳：火箭电泳： 单向免疫扩散单向免疫扩散 + 电泳电泳 （抗原定量）（抗原定量）免疫比浊：免疫比浊： 抗体抗体 + 递增量抗原递增量抗原比浊比浊（抗原定量）（抗原定量）现在学习的是第11页，共26页III ) Immunolabelling Techniques （三）

8、免疫标记技术（三）免疫标记技术标记物：标记物： 荧光素、酶、放射性核素、电子致密物质、化学发光物质荧光素、酶、放射性核素、电子致密物质、化学发光物质标记对象：抗原或抗体标记对象：抗原或抗体用途：用途： 定性、定量、定位定性、定量、定位免疫荧光法（免疫荧光法（IFA ） 荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位 （1）直接荧光法）直接荧光法 （2）间接荧光法：）间接荧光法： 荧光素一抗荧光素一抗 荧光素二抗荧光素二抗 对每种抗体作标记对每种抗体作标记 不必标记每种抗体不必标记每种抗体 特异特异 敏感敏感 测测Ag 测测Ag/Ab现在学习的是第1

9、2页，共26页免疫荧光法免疫荧光法现在学习的是第13页，共26页2. 酶免疫测定酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化与酶免疫组化（1）双抗体夹心法）双抗体夹心法ELISA：查抗原：查抗原（2）间接法）间接法ELISA： 查抗体查抗体（3）BAS-ELISA ： Biotin-Avidin-酶放大系统酶放大系统（4）ELISPOT测定法：测定法： _包被物包被物 待测物待测物 测定结果测定结果_ 抗抗CK抗体抗体 CK分泌细胞分泌细胞 单一单一CK 已知抗原已知抗原 B细胞细胞 特异特异B细胞细胞 （5）酶免疫组化）酶免疫组化* 酶标抗体酶标抗体 + 组织组织/细胞（未知抗原）细胞（未

10、知抗原） + 形态学检查形态学检查*免疫组化技术：可对抗原定性、定量、定位免疫组化技术：可对抗原定性、定量、定位 酶免疫组化：酶免疫组化： HRP免疫金银组化：免疫金银组化： 胶体金颗粒胶体金颗粒免疫电镜技术：免疫电镜技术： HRP、胶体金、铁蛋白、胶体金、铁蛋白现在学习的是第14页，共26页双抗体夹心法、间接法双抗体夹心法、间接法ELISA现在学习的是第15页，共26页间接法间接法ELISA现在学习的是第16页，共26页ELISA操作图可调移液器可调移液器8孔道可调移液器孔道可调移液器现在学习的是第17页，共26页3. 放射免疫测定放射免疫测定（RIA） 常用常用 125I，测定微量物质，测

11、定微量物质4. 化学发光免疫分析化学发光免疫分析 常用常用 鲁米诺，测定超微量物质鲁米诺，测定超微量物质5. 免疫印迹法（免疫印迹法（Western Blotting） 先做凝胶电泳将蛋白质分区先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定现在学习的是第18页，共26页第二节第二节 免疫细胞的测定免疫细胞的测定一、淋巴细胞的分离与类型鉴定淋巴细胞的分离与类型鉴定 （一）血细胞分离（一）血细胞分离 外周血外周血 密度梯度离心法密度梯度离心法 外周血单个核细胞（淋巴细胞外周血单个核细胞（淋巴细胞+单核

12、细胞）单核细胞） 吸附培养分离法吸附培养分离法 淋巴细胞淋巴细胞 尼龙毛，抗尼龙毛，抗CD3单抗，单抗，E花结花结 T细胞细胞 B细胞细胞现在学习的是第19页，共26页（二）淋巴细胞鉴定（二）淋巴细胞鉴定免疫荧光法免疫荧光法 常用间接法测常用间接法测CD3/CD4/CD8、mIgM/mIgD2. 磁珠分离法磁珠分离法 如抗如抗CD4抗体交联微珠可分离抗体交联微珠可分离CD4与与CD83. 流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry, FCM） 可分析细胞大小、核型、表面分子（多种荧光标记）可分析细胞大小、核型、表面分子（多种荧光标记） 检测各类免疫细胞及其比率检测各类免疫细胞及其比率

13、 白血病、淋巴瘤的免疫学分型白血病、淋巴瘤的免疫学分型 细胞分选细胞分选现在学习的是第20页，共26页二、淋巴细胞功能测定二、淋巴细胞功能测定（一）（一）T细胞功能测定细胞功能测定 1. T细胞增殖试验：细胞增殖试验： 丝裂原丝裂原/抗抗CD3刺激刺激/特异抗原特异抗原细胞增殖细胞增殖 （1）同位素掺入法）同位素掺入法 （2）MTT法法 （3）形态观测法）形态观测法 2. 细胞毒试验细胞毒试验 CTL、NK细胞杀伤靶细胞细胞杀伤靶细胞 （1）51Cr 释放法释放法 （2）凋亡细胞检查法）凋亡细胞检查法 阶梯状酶切图谱阶梯状酶切图谱 TUNEL法法 FCM现在学习的是第21页，共26页3. 细胞

14、因子检测细胞因子检测（1）免疫学检测法）免疫学检测法 夹心法夹心法ELISA FCM（2）生物学检测法）生物学检测法 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验细胞毒（或细胞毒抑制）试验 （3） 分子生物学检测法分子生物学检测法 RT-PCR测定测定mRNA4. 皮肤试验：皮肤试验： 测试测试IV型超敏反应能力型超敏反应能力现在学习的是第22页，共26页（二）（二）B细胞功能测定细胞功能测定B细胞增殖试验细胞增殖试验 小鼠：小鼠：LPS 人：人： SPA；抗；抗IgM2. 抗体形成细胞检测抗体形成细胞检测 溶血空斑试验溶血空斑试验 ELISPOT试

15、验试验现在学习的是第23页，共26页（三）吞噬细胞功能的测定（三）吞噬细胞功能的测定趋化功能测定趋化功能测定 Boyden 小室小室2. 吞噬功能测定吞噬功能测定 现在学习的是第24页，共26页第三节第三节 补体及循环免疫复合物的测定补体及循环免疫复合物的测定现在学习的是第25页，共26页III. Application of immunological techniques第四节第四节 免疫学检测方法的应用免疫学检测方法的应用1. Assessment and selection 一、免疫学检测方法的评估与选择免疫学检测方法的评估与选择 Reliability: true vs false 可靠性可靠性 ( gold standard*=真阴性率与真阳性率真阴性率与真阳性率) * Specificity= 真阴性真阴性/（真阴性（真阴性+假阳性）假阳性）x 100% * Sensitivity= 真阳性真阳性/（真阳性（真阳性+假阴性）假阴性）x 100% Safety 安全性安全性 Simplicity 简易性简易性 Saving of time and money 经济性经济性现在学习的是第26页，共26页