大肠杆菌分子克隆载体.ppt

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1、关于大肠杆菌分子克隆载体现在学习的是第1页，共42页一、一、E.coli克隆载体的种类克隆载体的种类 1. 质粒载体质粒载体复制起点来自一些天然质粒。复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体噬菌体载体，P1和和M13、fd载体，复制起点载体，复制起点来自噬菌体。来自噬菌体。 3. COS质粒载体质粒载体质粒载体中插入质粒载体中插入cos片段，以利片段，以利于体外包装于体外包装 4.4.噬粒载体（噬粒载体（phagemidphagemid）有质粒和有质粒和M13、fdfd的复的复制起点，以质制起点，以质粒或噬菌体方式复制。粒或噬菌体方式复制。 现在学习的是第2页，共42页二、质粒与质粒载体二

2、、质粒与质粒载体 1. Ecoli的质粒种类的质粒种类 1) colE1因子（大肠杆菌素因子）因子（大肠杆菌素因子）多数不能进行接合多数不能进行接合转移转移DNA，属高拷贝松弛型。，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子）因子（抗药性因子） 可接合转移可接合转移DNA，属低拷贝，属低拷贝 严紧型，严紧型， 质粒较大，操作不便质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子）因子（性因子）现在学习的是第3页，共42页2.质粒的特点质粒的特点 1) 质粒质粒DNA复制与染色体复制无关复制与染色体复制无关 2) 质粒质粒DNA以超螺旋形式存在以超螺旋形式存在 3) 质粒质粒DNA可以接合转移可以接合转移

3、 4) 质粒的不相容性和不相容群质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒质粒DNA的消除的消除化学和物理法化学和物理法(吖啶染料，吖啶染料，EtBr，高，高温等温等) 6) 质粒的整合质粒的整合F因子又可整合到因子又可整合到E.coli染色体中染色体中 3.质粒质粒DNA的转移的转移 1）质粒质粒DNA的转移过程的转移过程 现在学习的是第4页，共42页donor cellRecipient cellnick-ligation at oriTdonor cell3)分离2)tro基因表达1)重新环化DNA转移供体接合 DNA合成traT稳定化细胞壁接触不稳定接合对性繖毛收缩繖毛结合性繖毛-细胞壁接触

4、+质粒的自主转移过程质粒的自主转移过程 现在学习的是第5页，共42页5353质粒质粒DNA的转移和复制的转移和复制 现在学习的是第6页，共42页 2）质粒转移的必备条件质粒转移的必备条件 .转移起点转移起点(oriT),它是质粒它是质粒DNA转移时的复制起点转移时的复制起点顺式顺式 作用作用（cis-action） ii. 细胞附属物细胞附属物性纤毛，由蛋白质构成性纤毛，由蛋白质构成反式作用反式作用 .转移过程所需的全部酶类转移过程所需的全部酶类反式作用反式作用 3）质粒转移类型质粒转移类型 .自我转移（自我转移（Self-transmissible） .辅助转移（辅助转移（Donation）

5、可转移质粒仅具备可转移质粒仅具备oriT，若无辅助质，若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供所有反式作粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。用的蛋白质，前者便会发生接合转移。 .重组转移（重组转移（conduction）若质粒无若质粒无oriT，该质粒只有整，该质粒只有整合到辅助质粒合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。中，重组质粒便可转移。 因此，用于克隆外源因此，用于克隆外源DNADNA的分子克隆载体，只要具备的分子克隆载体，只要具备oriToriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上，该质粒一般即可，另外两类功能基因可置于

6、辅助质粒上，该质粒一般没有没有oriToriT，因而可以减少后者进入另一种细胞的频率。，因而可以减少后者进入另一种细胞的频率。 现在学习的是第7页，共42页+导入自主转移H +H donor无DNA转移H 辅助转移H质粒自主转移质粒自主转移R+RRR R+Notransfer+H H 重组DNA 转移质粒的辅助转移质粒的辅助转移质粒的重组转移质粒的重组转移 R-重组重组DNA分子分子 现在学习的是第8页，共42页 4.质粒质粒DNA的复制和调节控制的复制和调节控制 1) 复制机制复制机制复制方向、终止和方式复制方向、终止和方式 2) 质粒拷贝数的控制质粒拷贝数的控制抑制剂模型：高拷贝质粒需高浓

7、抑制剂模型：高拷贝质粒需高浓度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同一不相容群度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。 3) 质粒的复制调控机制质粒的复制调控机制 例子例子: ColE1质粒的复制及复制起点结构质粒的复制及复制起点结构 Boros etal.(1984)分离到一个分离到一个pBR322突变体，其拷突变体，其拷贝数可达贝数可达1000/ cell或或65%总总DNA，原因是在，原因是在RNAI基因基因的的3端附近发生一次端附近发生一次GT颠换。颠换。现在学习的是第9页，共42页-555bpRNA II(prim

8、ase)oriRNaseHColE1质粒质粒复制起点结构复制起点结构质粒质粒DNA的的复制过程复制过程 现在学习的是第10页，共42页5.大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体 1) 常用质粒载体的复制子常用质粒载体的复制子 质粒载体质粒载体 复制子来源复制子来源 拷贝数拷贝数 pBR322系列系列 pMB1 15-20 pUC系列系列 pMB1 500-700 pACYC系列系列 p15A 10-12 pSC101系列系列 pSC101 25 colE1 colE1 15-20 2) 质粒载体常用的遗传标记基因质粒载体常用的遗传标记基因 Apr Cmr Kanr Neor Tcr Hygr Lac

9、Z LacZ 3) 多克隆位点区多克隆位点区 大多数从大多数从pUCpUC系列中的多克隆位点衍生出来的系列中的多克隆位点衍生出来的 现在学习的是第11页，共42页 6.实例实例pUC18和和pUC19 pUC系列质粒载体由系列质粒载体由Messing et al.构建，具有三个显著特构建，具有三个显著特点：点： 1）分子量小，仅为）分子量小，仅为2.7KB，容纳外源，容纳外源DNA量增大量增大 2）易于检测是否有外源）易于检测是否有外源DNA插入的标记基因插入的标记基因LacZ 3）多克隆位点区）多克隆位点区 .多克隆位点成对地存在于多克隆位点成对地存在于pUC18和和pUC19中，位点排列顺

10、序相同中，位点排列顺序相同，但方向相反。，但方向相反。 这种排列方式有利于外源这种排列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入的克隆和定向插入 .产生不同末端规律排列产生不同末端规律排列: 两端限制酶位点产生两端限制酶位点产生5突起端（突起端（EcoRI和和Hind），与之相邻的两个限制酶位点产生），与之相邻的两个限制酶位点产生3突起突起端（端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四个限制酶位点产生），中央四个限制酶位点产生5突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入DNA片段的单片段的单向缺失和缺失片段的回收。向缺失和缺失片段的回收。现在学习的是第

11、12页，共42页EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)rpUC18和和pUC19载体载体现在学习的是第13页，共42页 如插入片段的如插入片段的5段定向缺失段定向缺失: XbaISphIExoS1T4 DNA lingase; 插入片段的插入片段的3-端亦可采用类似的方法进行缺失（端亦可采用类似的方法进行缺失（SmaISstIExoS1T4 DNA lingase

12、） 不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又例如不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又例如: pBS+多克隆位点区的排列顺序是多克隆位点区的排列顺序是(见图见图)： 假设有一假设有一EcoRIHind DNA片段，并要求在其片段，并要求在其3-末端或末端或5-端接上另外的端接上另外的DNA片段（如终止子、启动子），显然，片段（如终止子、启动子），显然，pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用pBS+中的中的多克隆位点区就能满足要求。多克隆位点区就能满足要求。 . 多克隆位点集中排列多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图

13、谱的绘制。有利于克隆片段的物理图谱的绘制。 除上述三个特点外，除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源基因系列载体还可用于表达外源基因 （LacZ启动子）。启动子）。现在学习的是第14页，共42页Plac Plac LacZorioriF1(-)Ampr T 3 T 7 pBS-SK(-)pBS-KS(-)pBS(3.0 kb)pBS载体的结构载体的结构现在学习的是第15页，共42页 三三. 噬菌体载体噬菌体载体 1. 噬菌体噬菌体载体载体 1）的结构和特点的结构和特点 i. 一般结构：一般结构：48,502bp，线状，线状ds-DNA，两端具有，两端具有12n.t 5-突起突起（5-

14、GGGCGGCGACCT-3）该末端称为）该末端称为cos位点，可被位点，可被编码的末端酶所识别（该酶由编码的末端酶所识别（该酶由末端的两个基因末端的两个基因Nul和和A编编码蛋白码蛋白gpNul和和gpA组成）组成） ii. 基因结构基因结构46个基因，分为以下四类：个基因，分为以下四类： ) 调控基因：调控基因：C、N、CI、Cro、C决定进入溶源化还决定进入溶源化还是裂解状态是裂解状态 ) DNA复制：复制：O、P、Q )重组：重组：int、xis、red和和gam )噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾、尾(E-J)、S & R （细胞裂解）细胞裂解）

15、中部约中部约1/3的的DNA(b2)与与存活无关。存活无关。现在学习的是第16页，共42页w G T A B C D E Z U V H K I J N O P Q S R 免疫和调控整合切除、重组DNA合成宿主裂解att PIkiltLOLPLNPMtMOriPRtR1ORTR2cIintexocIII relOPQSRPRCrotLOLORtR1PLtR2NPR后早期激活后期tMPMP ECI阻遏物溶源性建立和保持M L头 尾Pi大肠杆菌大肠杆菌噬菌体的基因和表达调控噬菌体的基因和表达调控现在学习的是第17页，共42页 2) 噬菌体基因的表达噬菌体基因的表达 i. 最早期转录：转录起始于最

16、早期转录：转录起始于CI基因两侧的基因两侧的PL和和PR启动子，止于启动子，止于N和和Cro末端的末端的tL和和tR1，有的右向转录物可継续通过，有的右向转录物可継续通过O和和P止于止于tR2。 ii. 后早期转录：后早期转录：N蛋白可使宿主细胞转录终止因子蛋白可使宿主细胞转录终止因子失活，导失活，导致转录通过致转录通过tR1、tR2和和tL进入其余早期基因区域。进入其余早期基因区域。 iii. 后期转录：后期转录：cro蛋白可与蛋白可与OL和和OR结合，阻止结合，阻止RNA聚合酶与聚合酶与PL和和PR结合，转录终止，此时已合成了足够多的控制蛋白结合，转录终止，此时已合成了足够多的控制蛋白Q，

17、它对，它对PR起激活作用，导致后期基因转录。起激活作用，导致后期基因转录。 iv. DNA复制：因早期转录获复制：因早期转录获DNA复制蛋白复制蛋白O和和P，双向复制开，双向复制开始。始。 v. 包装：包装：Nul和和A蛋白与蛋白与DNA的的cos位点的识别与切割，位点的识别与切割，FI蛋白蛋白促进促进DNA进入头部蛋白，进入头部蛋白，DNA充满后，充满后，gpw和和gpF将头部将头部封住，然后与尾部相连，形成噬菌体颗粒。封住，然后与尾部相连，形成噬菌体颗粒。现在学习的是第18页，共42页 vi. 裂解：基因裂解：基因R和和S产物形成，细菌细胞裂解，噬菌体颗粒释产物形成，细菌细胞裂解，噬菌体颗

18、粒释放。放。 vii. 溶源反应：溶源反应：C和和C基因产物分别激活基因产物分别激活PE和和PI的左向转录，的左向转录，致使致使CI和和int基因表达，基因表达，CI 产物可阻止早期转录，导致后期产物可阻止早期转录，导致后期基因表达受阻。基因表达受阻。 对于裂解反应和溶源反应的选择，取决于感染细胞中一系对于裂解反应和溶源反应的选择，取决于感染细胞中一系列宿主和噬菌体因子间错综复杂的精细平衡关系。列宿主和噬菌体因子间错综复杂的精细平衡关系。* 当当DNA注入宿主细胞后，线状注入宿主细胞后，线状DNA首先环化为环状首先环化为环状DNA，这，这种环化有以下几点好处：种环化有以下几点好处： a. 若为

19、单向复制，不管从何处开始复制，全基因组均若为单向复制，不管从何处开始复制，全基因组均 可全可全部复制部复制 b. 噬菌体噬菌体DNA插入宿主染色体插入宿主染色体DNA，只需一次位点特，只需一次位点特异性重组异性重组 c. 拓扑异构酶易于对其进行不足和过度加旋拓扑异构酶易于对其进行不足和过度加旋 d. 受损的基因组增大了存活的可能性，因为双向复制不受损的基因组增大了存活的可能性，因为双向复制不会受阻于会受阻于 损伤的损伤的DNA链，而单向复制就不能通过链，而单向复制就不能通过 现在学习的是第19页，共42页 3) DNA的复制的复制细胞外细胞内现在学习的是第20页，共42页4) DNA的包装过程

20、的包装过程 l l 头头尾连接器由尾连接器由12分子分子gpB构成中空结构，构成中空结构，groE1和和groES负责装配负责装配 l l pX由由10个杂合的个杂合的gpC和和gpE构成，使连接器定位构成，使连接器定位 l l gpW和和gpF结合在连接器上，防止结合在连接器上，防止DNA外泄，提供尾部粘着点外泄，提供尾部粘着点末末端酶端酶由两基因产物组成（由两基因产物组成（Nul和和A），），gpNul2-gpA1 (20,444 x 2 + 72,280 = 113,168) 该酶具有以下多种酶活性该酶具有以下多种酶活性：1）特异）特异DNA位点结合；位点结合；2）特异位点切口）特异位点

21、切口形成；形成；3）头前体结合；）头前体结合；4）gpFI结合；结合；5）cos位点变性；位点变性；6）DNA转位；转位；7）DNA序列扫描；序列扫描；8）ATP结合；结合；9）ATP水解。水解。 因此，头部蛋白因此，头部蛋白gpEgpE和和gpDgpD以及包装蛋白以及包装蛋白gpAgpA是是DNADNA形成噬菌体颗形成噬菌体颗粒必不可少的组分，体外包装物的制备就是依据这一结论粒必不可少的组分，体外包装物的制备就是依据这一结论 现在学习的是第21页，共42页头-尾连接器gpB gp Nu3gp gro ELgp gro ESgpc.E gpNu3gpE px gpc gpA gpNu1 E.c

22、oliE.coli INF Or THFgpFII gpw gpD末端酶复合物II (F1可促进该复合物形成）扩张复合物IDNANu1 左端 ABCNu3DEFIFIIWDNA的包装的包装 现在学习的是第22页，共42页 5）DNA作载体的缺点和解决办法作载体的缺点和解决办法 i.头部只能容纳自身头部只能容纳自身DNA的的78-105%，即，即39-52.5 Kb，天然，天然仅可插入仅可插入3 Kb外源外源DNA片段片段除去所有与除去所有与裂解无关的基因和裂解无关的基因和空白区，最大可插入空白区，最大可插入22 Kb。 ii.同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源同一种限制酶具有多个识别位点

23、，不利于外源DNA插入插入体体内突变和建立新的克隆位点。内突变和建立新的克隆位点。 .重组的重组的DNA分子难于直接导入宿主细胞分子难于直接导入宿主细胞利用体外包装成病利用体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA。 6) 载体的种类载体的种类 i. 插入型插入型即将外源即将外源DNA直接插入已构建载体中，如直接插入已构建载体中，如gt11，可，可以插入长达以插入长达7 Kb的的DNA。这类载体被限制酶切成左右臂。这类载体被限制酶切成左右臂。 .取代型取代型即利用一段外源即利用一段外源DNA去取代载体中的一段去取代载体中的一段DNA，而这段而这段DNA常含有

24、一定的标记基因。这类载体常被限制酶切常含有一定的标记基因。这类载体常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。为三段：左臂、隔离段和右臂。 * 有的取代型有的取代型载体亦可用作插入型载体载体亦可用作插入型载体,如如Charon 4A现在学习的是第23页，共42页左臂 隔离段 右臂E Xb E E 50kb lac5 bio256 KH54nin5 QSR80限制酶 克隆方式： EcoRI取代法E E 20.1kb 7.1kbXbI 插入法 Xb Xb 5.64 0大肠杆菌大肠杆菌载体载体Charon 4Ared gamred gamP2 导入 外源DNA 取代无噬菌斑+ P2导入滚环复制-Spi

25、重组子的筛选重组子的筛选 现在学习的是第24页，共42页7) 载体的遗传标记基因和重组子筛选载体的遗传标记基因和重组子筛选 由于由于载体或重组载体或重组DNA是通过感染途径进入宿主细胞的，因而形是通过感染途径进入宿主细胞的，因而形成的噬菌斑就是一个明显的标记。用于重组子检测的遗传标记基因成的噬菌斑就是一个明显的标记。用于重组子检测的遗传标记基因主要有主要有lacZ 基因。不管是用插入或取代法，该标记基因均会失活。基因。不管是用插入或取代法，该标记基因均会失活。 利用利用spi-选择重组子选择重组子：野生型：野生型不能在不能在P2溶源化菌种中成活，称之溶源化菌种中成活，称之为为spi+(sens

26、itive to P2 interference)，这与，这与red和和gam基因有关。若用基因有关。若用外源外源DNA将这些基因取代，形成的重组将这些基因取代，形成的重组DNA分子可在分子可在P2菌中株中菌中株中存活，并形成噬菌斑。存活，并形成噬菌斑。载体载体1059、L47.1均属此类，这种选择均属此类，这种选择方式亦称之为显性选择。方式亦称之为显性选择。现在学习的是第25页，共42页 2. P1噬菌体载体噬菌体载体 1) 基本结构与特征基本结构与特征 i. 基因组长基因组长88 kb, 在噬菌体颗粒中的在噬菌体颗粒中的DNA长长100 kb, 呈线状呈线状,其中约有其中约有12%的多余的

27、多余DNA; ii. 可以低拷贝质粒形式存在于细菌细胞中可以低拷贝质粒形式存在于细菌细胞中, 又可以烈性噬菌体又可以烈性噬菌体形式进行复制形式进行复制; iii. P1噬菌体包装原理噬菌体包装原理: 渐进满头机制（渐进满头机制（processive headful mechanism） 底物底物: 滚环复制过程形成的头尾相连串状体滚环复制过程形成的头尾相连串状体 现在学习的是第26页，共42页 包装过程包装过程: 始于一个长始于一个长162bp的的P1 pac位点位点，识别和切割此位，识别和切割此位点的是点的是P1编码的编码的pacase，切出的，切出的pac一端进入预制头部，当其头部一端进入

28、预制头部，当其头部充满充满DNA后，后，DNA再次被切。再次被切。第二次切割是随机的第二次切割是随机的，无特异，无特异性性DNA序列。第二轮包装则从非特异性切割出的末端开始。序列。第二轮包装则从非特异性切割出的末端开始。因此，多次包装都是从一个因此，多次包装都是从一个pac位点开始的。位点开始的。P1头部可容头部可容110Kb。 pac位点位点: 一端含一端含4个六聚体个六聚体(5 TGATCA/G 3)，另一端则有三，另一端则有三个，中间区域长个，中间区域长90 bp，pacase切点位于靠近切点位于靠近90 bp区的中心序列区的中心序列。每个六聚体都有一个腺嘌呤甲基化位点。每个六聚体都有一

29、个腺嘌呤甲基化位点(damGATC), pacase 只作用甲基化的只作用甲基化的pac位点位点.现在学习的是第27页，共42页PacP1基因组(88 kb)大肠杆菌大肠杆菌P1噬菌体基因组和包装噬菌体基因组和包装现在学习的是第28页，共42页 2) P1载体载体-pAd10 sacB i. 优点优点 i) 可克隆较大插入片段可克隆较大插入片段, 可插入可插入95Kb外源外源DNA，二倍于，二倍于cos质粒载体质粒载体 ii) 较高的转化频率较高的转化频率, 12g载体载体 + 24g外源外源DNA105转化子转化子 iii) 与与YAC载体相比，它易于产生多拷贝的基因组片段载体相比，它易于产

30、生多拷贝的基因组片段; 易易于获得大量特定的克隆于获得大量特定的克隆DNA; 克隆过程更可靠克隆过程更可靠; 克隆片段易克隆片段易于进行次克隆于进行次克隆 ii. 结构结构 载体被二个载体被二个loxP重组位点分隔为两区重组位点分隔为两区 Ampr和和Kanr区区 Ampr区：来自区：来自pBR322的的ori, pac位点位点(反时针包装反时针包装), 来来自腺病毒的自腺病毒的11Kb填充片段填充片段(插入到插入到Sca位点位点) Kanr 区：区：Kanr(Tn903)和和Tetr基因，基因，P1质粒复制子和分质粒复制子和分离系统，离系统，P1裂解复制子，其活性受裂解复制子，其活性受lac

31、操纵基因启动子操纵基因启动子控制控制现在学习的是第29页，共42页E.coli promotersacBP1 repressorbinding siteT7 T3 SalISfiINotI BamHI loxPAmpAd10 pAD10sacBII(29.3 kb)XbaIScaIpacloxPtetlyt Repplasmid Rep kanr大肠杆菌大肠杆菌P1噬菌体载体噬菌体载体p Ad10 sacB 现在学习的是第30页，共42页sacBBamHI+ 95 kb DNA fragment pac loxPsacBKanDNA headful +Cre Recombi- lation D

32、NAAmplifi- cationpac cleavageproteinloxPAmpAd10 pAD10sacBII(29.3 kb)XbaIScaIpacloxPlyt Repplasmid Rep kanrrP1噬菌体载体构建噬菌体载体构建基因组文库的示意图基因组文库的示意图pAd10 sacB ScaI+BamHI 长臂长臂 + 短臂短臂 加入外源加入外源DNA片段片段 重组重组DNA分子分子 离体包装离体包装 感染宿主细胞感染宿主细胞现在学习的是第31页，共42页 SacB基因基因:编码一种编码一种将蔗糖转化为果聚糖的酶将蔗糖转化为果聚糖的酶，当含该基因的细胞，当含该基因的细胞培养在

33、培养在2%以上蔗糖培养基中时以上蔗糖培养基中时,果聚糖积累在细胞周质空间内，导致大肠杆果聚糖积累在细胞周质空间内，导致大肠杆菌细胞死亡菌细胞死亡 SacB基因被克隆到原基因被克隆到原Tetr 基因的基因的BamHI- SalI间间,在其上游加上在其上游加上E.coli基因启动子基因启动子,克隆位点克隆位点BamHI位于这两个位于这两个DNA片段间片段间,外源外源DNA片段插入时片段插入时可进行可进行显性筛选重组子显性筛选重组子 为了为了使使sacB基因自发突变减小到最小限度基因自发突变减小到最小限度,sacB基因上游还有一个基因上游还有一个P1 C1阻遏物结合位点阻遏物结合位点与其启动子重叠。

34、与其启动子重叠。凡是表达凡是表达P1 C1基因的细胞，基因的细胞，sacB基因表达受阻，在无蔗糖条件下，这种细胞会生长得更好基因表达受阻，在无蔗糖条件下，这种细胞会生长得更好 iii. 克隆策略克隆策略 3.3kb短臂短臂：含：含pac,loxP,无启动子的无启动子的sacB 26kb长臂长臂: 含含P1裂解复制子，裂解复制子，Kanr，P1质粒复制子，质粒复制子，loxP 位点位点现在学习的是第32页，共42页包装包装: 重组重组DNA分子先用分子先用pacase或抽提物或抽提物酶切酶切pac位点，然后用抽位点，然后用抽提物提物（含头部和尾部）进行包装直至头部充满（含头部和尾部）进行包装直至

35、头部充满DNA，最后与，最后与尾部相连成有感染力的重组尾部相连成有感染力的重组P1噬菌体颗粒。噬菌体颗粒。 iV. 重组重组DNA分子形成分子形成 当重组当重组DNA分子进入宿主细胞后，特异性位点重组发生分子进入宿主细胞后，特异性位点重组发生在两个方向相同的在两个方向相同的loxP位点，该过程由宿主细胞表达的重组酶（位点，该过程由宿主细胞表达的重组酶（Cre）催化）催化 v. 宿主菌宿主菌 E.coli NS3529菌株基因型菌株基因型recA-，lacq，mcrABC，mrr: recA-:防止插入防止插入DNA片段内的同源重组，以免发生重排片段内的同源重组，以免发生重排; lacq : 抑

36、制抑制P1裂解复制子的激活裂解复制子的激活, 使使P1质粒复制子在细胞中以单拷贝形式存在质粒复制子在细胞中以单拷贝形式存在，亦防止外源，亦防止外源DNA分子重排分子重排; mcr和和mrr: 抑制富含抑制富含GpMeC或或ApMeC插入片段的选择性丢失插入片段的选择性丢失现在学习的是第33页，共42页 3. M13和和fd载体载体 1) 结构特征结构特征环状环状ssDNA，病毒颗粒呈丝状，病毒颗粒呈丝状 2) 复制过程复制过程：ss（+） RF(0-1 min) RF RF(0-20 min) RF ss(+)(20 min)DNA包装无严格限制包装无严格限制 3) 生活史生活史 a. 病毒粒

37、子靠小分子衣壳蛋白和病毒粒子靠小分子衣壳蛋白和A蛋白附着于性纤毛顶端（蛋白附着于性纤毛顶端（E.coli中中F因子提供）因子提供） b. 病毒病毒DNA和和A 蛋白进入细胞内，大部分衣壳蛋白则留在细胞膜蛋白进入细胞内，大部分衣壳蛋白则留在细胞膜上上 c. 病毒病毒DNA变为双链复制形式（变为双链复制形式（RF）, 衣壳蛋白可能为衣壳蛋白可能为DNA复制提供复制提供附着位点附着位点 d. RF进行滚环复制，形成单链，同时基因与蛋白质结合进行滚环复制，形成单链，同时基因与蛋白质结合 e. ssDNA环化，并形成线状的环化，并形成线状的DNA基因与蛋白质复合物基因与蛋白质复合物 f. 病毒病毒DNA

38、穿膜时，基因与蛋白质被附着于膜上的衣壳蛋白取穿膜时，基因与蛋白质被附着于膜上的衣壳蛋白取代，完整病毒从细胞中释放，释放时不杀死细胞，但因感染代，完整病毒从细胞中释放，释放时不杀死细胞，但因感染细胞生长缓慢，仍然可见噬菌斑细胞生长缓慢，仍然可见噬菌斑现在学习的是第34页，共42页M13噬菌体的生活史噬菌体的生活史 现在学习的是第35页，共42页 1）基因结构基因结构 基因基因、和和编码特异性蛋白质，参与病毒颗粒的组装编码特异性蛋白质，参与病毒颗粒的组装 基因基因参与参与DNA复制复制 基因基因、和和编码编码M13的结构蛋白的结构蛋白 基因基因参与单链复制过程中的环化作用参与单链复制过程中的环化作

39、用 基因基因是衣壳蛋白的重要组成部分是衣壳蛋白的重要组成部分 2）M13mp系列载体系列载体 a. 特点特点：在：在IR区中插入一个区中插入一个lacZ基因，然后在该基因中逐渐构基因，然后在该基因中逐渐构建一个多克隆位点区，建一个多克隆位点区，ds-DNA可用常规方法直接导入，可用常规方法直接导入，ss-DNA常用常用感染的方法感染的方法 噬菌斑的形成用于选择噬菌斑的形成用于选择DNA导入的细胞，在导入的细胞，在X-Gal平板上形成的无平板上形成的无色噬菌斑检测重组子色噬菌斑检测重组子 b. 优点优点：易于获得：易于获得ss-DNA用于用于DNA序列测定和基因突变，从细序列测定和基因突变，从细

40、胞中易于检测分离到胞中易于检测分离到RF型的型的ds-DNA用于外源用于外源DNA重组重组M13mpM13mp系列载体的多克隆位点区系列载体的多克隆位点区 现在学习的是第36页，共42页四四. COS质粒载体质粒载体 1. 结构特点结构特点：在普通质粒载体中插入一个或两个来自在普通质粒载体中插入一个或两个来自的的cos位点片段位点片段, 双双cos载体比单载体比单cos载体易于重组载体易于重组 l l cos位点的精细结构位点的精细结构 cos长长200 bp，由以下几个亚单位组成：，由以下几个亚单位组成： a. cosN由由末端酶的末端酶的gpA亚基识别和切割，产生亚基识别和切割，产生5-1

41、2 n.t突起；突起； b. cosB分别位于分别位于cosN的两侧，称之为的两侧，称之为cosBL（左侧）和（左侧）和cosBR（右侧），为（右侧），为蛋白质结合位点蛋白质结合位点。 R1、R2和和R3长长16 bp，其中有，其中有12个个n.t相等，可与相等，可与gpNul蛋蛋白进行体外结合。白进行体外结合。 R4与上述三个与上述三个R片段仅有片段仅有8个个n.t相等，不能与相等，不能与gpNul蛋白进蛋白进行体外结合，但可以和全酶结合（行体外结合，但可以和全酶结合（ATP存在时）。存在时）。 I1为为IHF结合位点。结合位点。现在学习的是第37页，共42页Cos B CosN R3 I1

42、 R2 R1 Nu1 +200-80COS位点的结构位点的结构现在学习的是第38页，共42页 2. 优点优点 . 容量大（可达容量大（可达48 kb），用于基因簇的克隆），用于基因簇的克隆 . 形成的重组形成的重组DNA分子可进行体外包装，并能感染分子可进行体外包装，并能感染E.coli细细 胞（在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形胞（在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑）成噬菌斑） . 操作简便，可直接转化细胞操作简便，可直接转化细胞 . 对重组对重组DNA分子长度具有选择性包装分子长度具有选择性包装 3.遗传标记遗传标记：与质粒载体相同，利用抗生素抗性选择转与质粒载体相同，利用

43、抗生素抗性选择转化子化子 例子例子: : pJB8和和C2XB 现在学习的是第39页，共42页C2XB(6.6 kb)COSCOSSm B HCEAmpr COSpJB8(5.4 kb)PE B ECHSm ACOS质粒载体结构图质粒载体结构图 现在学习的是第40页，共42页五五. 噬粒载体（噬粒载体（phagemid） 1. 结构特点结构特点：在质粒载体中插入一段在质粒载体中插入一段M13或或fd的复制起点的复制起点，其插入方向决定在噬菌体颗粒中形成正链还是负链，其插入方向决定在噬菌体颗粒中形成正链还是负链 2. 优点优点 .可以质粒方式复制，高拷贝存在于可以质粒方式复制，高拷贝存在于E.coli细胞中，便于大量细胞中，便于大量提取质粒提取质粒DNA用于用于DNA重组重组 .当有辅助噬菌体存在时（如当有辅助噬菌体存在时（如M13K07和和R408），噬质粒重组），噬质粒重组DNA分子将以分子将以f1复制起点开始进行复制，形成单链复制起点开始进行复制，形成单链DNA和和噬菌体颗粒，形成的单链噬菌体颗粒，形成的单链DNA可用于定序和特异位点突变可用于定序和特异位点突变现在学习的是第41页，共42页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第42页，共42页