分子生物学核酸的分子操作讲稿.ppt

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1、分子生物学核酸的分子操作第一页，讲稿共七十一页哦工具酶的种类 核酸酶：用于切割或降解核酸分子。核酸酶：用于切割或降解核酸分子。连接酶：用于把核酸分子连接到一起。连接酶：用于把核酸分子连接到一起。聚合酶：用于核酸分子的扩增和拷贝。聚合酶：用于核酸分子的扩增和拷贝。修饰酶：用于给核酸分子添上或减去某些修饰酶：用于给核酸分子添上或减去某些 化学基团或核苷酸。化学基团或核苷酸。第二页，讲稿共七十一页哦工具酶的来源 这四大类酶大都是从细菌和噬菌体中纯化出来的，在细胞这四大类酶大都是从细菌和噬菌体中纯化出来的，在细胞中它们原本就参与中它们原本就参与DNA复制、复制、RNA转录、降解外来核酸分子、转录、降解

2、外来核酸分子、修复突变的修复突变的DNA分子和不同分子和不同DNA分子间重组等一系列重要分子间重组等一系列重要的生命反应过程。在重组的生命反应过程。在重组DNA技术中，它们被用来在人工技术中，它们被用来在人工控制的条件下（体外）工作。值得一提的是，绝大多数这类控制的条件下（体外）工作。值得一提的是，绝大多数这类酶促反应是无法用其它方法来替代完成的，这种不可替代性酶促反应是无法用其它方法来替代完成的，这种不可替代性使这些工具酶在重组使这些工具酶在重组DNA技术中占据了极其重要的地位。技术中占据了极其重要的地位。第三页，讲稿共七十一页哦限制性内切酶的发现 20世纪世纪50年代初有两个实验室在研究噬

3、菌体的宿主范年代初有两个实验室在研究噬菌体的宿主范围时相继发现，当一个噬菌体从其天然宿主，如围时相继发现，当一个噬菌体从其天然宿主，如E.coli的品的品系系A，转到另一个品系，转到另一个品系B时，往往不能生长。但如果进行时，往往不能生长。但如果进行大量的感染，则有个别噬菌体能生存下来。研究表明，大量的感染，则有个别噬菌体能生存下来。研究表明，噬菌体在非天然宿主品系中不能生存，是因为噬菌体的噬菌体在非天然宿主品系中不能生存，是因为噬菌体的DNA被降解了，而细菌自身的被降解了，而细菌自身的DNA却不被降解。为了解却不被降解。为了解释这种现象，人们提出了限制修饰酶假说。释这种现象，人们提出了限制修

4、饰酶假说。第四页，讲稿共七十一页哦限制修饰假说 限制修饰假说认为，细菌细胞中含有两种酶，一种是限制修饰假说认为，细菌细胞中含有两种酶，一种是限制性核酸内切酶，一种是限制性核酸内切酶，一种是DNA甲基化酶，这两种酶成对甲基化酶，这两种酶成对出现，二者对出现，二者对DNA分子有相同的识别序列。分子有相同的识别序列。DNA甲基化酶甲基化酶在识别序列处特定的核苷酸上甲基化。限制性内切酶只能切割在识别序列处特定的核苷酸上甲基化。限制性内切酶只能切割非甲基化的非甲基化的DNA，而不能切割不完全甲基化和完全甲基化的，而不能切割不完全甲基化和完全甲基化的DNA。因此，非甲基化的外来。因此，非甲基化的外来DNA

5、会被限制性内切酶降解。会被限制性内切酶降解。第五页，讲稿共七十一页哦完全甲基化和不完全甲基化 一条链上甲基化而另一条链上没有甲基化的称为一条链上甲基化而另一条链上没有甲基化的称为不完全甲基化（如刚经过半保留复制的不完全甲基化（如刚经过半保留复制的DNA分子），分子），两条链都甲基化的称为完全甲基化。两条链都甲基化的称为完全甲基化。DNA甲基化酶可以甲基化酶可以对非甲基化的及不完全甲基化的识别序列进行甲基化。对非甲基化的及不完全甲基化的识别序列进行甲基化。1968年从大肠杆菌中发现了年从大肠杆菌中发现了型限制性内切酶，型限制性内切酶，1970年分离出了年分离出了型限制性内切酶，从而证实了上述假说

6、。型限制性内切酶，从而证实了上述假说。第六页，讲稿共七十一页哦各种类型限制性内切酶的性质比较各种类型限制性内切酶的性质比较 性性 质质 型型 型型 型型蛋白质结构和蛋白质结构和功能功能独立的内切酶和甲基独立的内切酶和甲基化酶化酶由由2个亚基组成的个亚基组成的双功能酶双功能酶由由3个亚基组成的个亚基组成的复合功能酶复合功能酶识别部位识别部位短小序列（大多为短小序列（大多为46 bp），常为回文结构），常为回文结构57bp的不对称序的不对称序列列不对称序列，例如不对称序列，例如（AACN6GTGC)*切割部位切割部位同于或接近于同于或接近于识别部位识别部位距识别位点距识别位点3端端2426bp处处

7、非特异性，距识别非特异性，距识别部位大于部位大于1000bp限制作用所需限制作用所需的辅助因子的辅助因子Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸ATP、Mg2+、S-腺腺苷甲硫氨酸苷甲硫氨酸第七页，讲稿共七十一页哦型限制性内切酶的特点 型酶分子量小，为单亚基多体酶（同源二聚体），以型酶分子量小，为单亚基多体酶（同源二聚体），以Mg2+为辅助因子，只有切割作用，没有修饰作用（有独立的与为辅助因子，只有切割作用，没有修饰作用（有独立的与之相匹配的甲基化酶）。之相匹配的甲基化酶）。型酶的识别序列一般为型酶的识别序列一般为46个个bp,切割位点在识别序列内或相邻处（切割位点在识别序列内或

8、相邻处（s型，型，shifted cleavage），见表），见表52。切割位点在识别位点相邻处的例。切割位点在识别位点相邻处的例子如子如Hga，其识别序列和切割位点记为，其识别序列和切割位点记为GACGC（5/10），表示切割位点为，表示切割位点为 5 G A C G C N N N N N 3 3 C T G C G N N N N N N N N N N 5第八页，讲稿共七十一页哦表表52 部分部分型限制性内切酶及其切割位点型限制性内切酶及其切割位点酶酶盐浓度盐浓度温度温度识别序列及识别序列及切割位点切割位点切割产生的末端切割产生的末端EcoR高高37 GAATTC(5 突出粘性末端）突

9、出粘性末端）-G AATTC-CTTAA G-Hae 中中37 GGCC（平端）（平端）-GG CC-CC GG-Mbo 高高37 GATC（5 突出粘性末端）突出粘性末端）-GATC-CTAG -Pst 中中2137 CTGCAG（3 突出粘性末端）突出粘性末端）-CTGCA G-G ACGTC-第九页，讲稿共七十一页哦限制性内切酶切割位点的多寡 如果如果DNA上的核苷酸顺序是随机的，则对于以上的核苷酸顺序是随机的，则对于以4个个bp为识别序列的为识别序列的型酶来说，平均型酶来说，平均44（256）个核）个核苷酸就有一个靶序列；而对于以苷酸就有一个靶序列；而对于以6个个bp为识别序列的为识别

10、序列的酶则平均酶则平均46（4096）个核苷酸就有一个靶序列。）个核苷酸就有一个靶序列。第十页，讲稿共七十一页哦同裂酶和同尾酶 具有相同识别序列的酶称为同裂酶（具有相同识别序列的酶称为同裂酶（isoschizomers），切割位点可以相同也可以不同。如），切割位点可以相同也可以不同。如Mbo和和Sau3A的识别序列和切割位点均为的识别序列和切割位点均为GATC，Xma的的识别序列和切割位点为识别序列和切割位点为CCCGGG，而具有与其相同识，而具有与其相同识别序列的别序列的Sma的切割位点为的切割位点为CCCGGG。识别序列不同，但切出的粘性末端相同的酶称为同尾识别序列不同，但切出的粘性末端相

11、同的酶称为同尾酶（酶（isocaudamers）。例如）。例如 BamH GGATCC Bgl AGATCT Bcl TGATCA Sau3A GATC第十一页，讲稿共七十一页哦型限制性内切酶所需反应条件 反应温度和时间：反应温度和时间：37保温适当长的时间，保温时间一保温适当长的时间，保温时间一般从半小时到数小时，可通过预备实验确定或按文献资料般从半小时到数小时，可通过预备实验确定或按文献资料进行。进行。反应体积：一般为几十反应体积：一般为几十l。底物底物DNA：用无：用无DNase的的RNase除去可能污染的除去可能污染的RNA；用乙醇多次沉淀可除去各种杂质（如酚、；用乙醇多次沉淀可除去各

12、种杂质（如酚、SDS、EDTA等），最后吹干乙醇并溶于适当的缓冲液中。等），最后吹干乙醇并溶于适当的缓冲液中。第十二页，讲稿共七十一页哦型限制性内切酶所需反应条件 反应系统：缓冲液应过滤除菌或高压灭菌，根据不反应系统：缓冲液应过滤除菌或高压灭菌，根据不同的限制性内切酶选择高、中、低盐浓度。当用两种同的限制性内切酶选择高、中、低盐浓度。当用两种以上的限制性内切酶切割时，应先用需低盐浓度的酶以上的限制性内切酶切割时，应先用需低盐浓度的酶，再用需高盐浓度的酶。所加酶量要适当。，再用需高盐浓度的酶。所加酶量要适当。1单位酶的单位酶的定义：在限定的温度（一般为定义：在限定的温度（一般为37）和缓冲液条件

13、下，）和缓冲液条件下，在在20l反应液中，反应液中，1小时消化小时消化1g DNA所需的酶量。所需的酶量。第十三页，讲稿共七十一页哦限制性内切酶的命名 第一个大写字母（斜体）为产酶微生物属名的第一个第一个大写字母（斜体）为产酶微生物属名的第一个字母，第二、三两个小写字母（斜体）为种名的前两个字字母，第二、三两个小写字母（斜体）为种名的前两个字母，第四个大写或小写字母（正体）为变种或株系名的第母，第四个大写或小写字母（正体）为变种或株系名的第一个字母，最后的罗马数字为序号（从同一种微生物中分一个字母，最后的罗马数字为序号（从同一种微生物中分离出了几种限制性内切酶时按发现和分离的先后顺序编号离出了

14、几种限制性内切酶时按发现和分离的先后顺序编号）。）。流感嗜血杆菌（流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）Rd株：株：Hind大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）Ry13株：株：EcoR淀粉液化芽孢杆菌（淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）H株：株：B BamH第十四页，讲稿共七十一页哦核酸的凝胶电泳 为了检测酶切后为了检测酶切后DNA片段的大小，必须进行凝胶电泳片段的大小，必须进行凝胶电泳分离。往电泳体系中加溴化乙锭或电泳结束后用溴化乙锭分离。往电泳体系中加溴化乙锭或电泳结束后用溴化乙锭染色，就可以在紫外光下看到染色，

15、就可以在紫外光下看到DNA带，灵敏度可达带，灵敏度可达5ng。RNA电泳也可用溴化乙锭染色，但灵敏度低得多。电泳也可用溴化乙锭染色，但灵敏度低得多。DNA凝胶电泳常以琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶为介质凝胶电泳常以琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶为介质，前者用于较大片段的分离，后者用于较小片段的分离和序列，前者用于较大片段的分离，后者用于较小片段的分离和序列测定。测定。第十五页，讲稿共七十一页哦溴化乙锭结构式第十六页，讲稿共七十一页哦表表53 凝胶浓度与凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围分子的有效分离范围凝胶种类凝胶种类凝胶浓度凝胶浓度（%）分离线性分离线性DNA的的有效范围有效范围二甲苯青二甲苯青溴酚

16、蓝溴酚蓝琼脂糖琼脂糖0.30.60.91.21.52.05 60 kb1 20 kb0.5 7 kb0.4 6 kb0.2 4 kb0.1 3 kb1000 bp150 bp聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺3.55.08.012.020.0100 2000 bp80 500 bp60 400 bp40 200 bp6 200 bp460 bp260 bp160 bp70 bp45 bp100 bp65 bp45 bp20 bp15 bp第十七页，讲稿共七十一页哦DNA大小与迁移距离的关系 在一定范围在一定范围内，内，DNA分子迁分子迁移的距离与其核移的距离与其核苷酸对（苷酸对（bp）的对数成反比的对数成反

17、比。第十八页，讲稿共七十一页哦DNA分子的状态与迁移速度的关系 在无在无EB下电泳，下电泳，cccDNA泳动速度最快，泳动速度最快，linear DNA次之次之，ocDNA最慢。随着最慢。随着EB浓度的增加，更多的浓度的增加，更多的EB结合到结合到DNA上，上，cccDNA分子的负超螺旋逐渐解开，其分子半径增加，分子的负超螺旋逐渐解开，其分子半径增加，迁移速率减小。达到游离染料的临界浓度时，不再有超螺迁移速率减小。达到游离染料的临界浓度时，不再有超螺旋，旋，cccDNA分子的迁移速率达最小值。继续增加分子的迁移速率达最小值。继续增加EB，便形，便形成正超螺旋，成正超螺旋，DNA分子变得更加致密

18、，迁移速率迅速增加。对分子变得更加致密，迁移速率迅速增加。对绝大多数绝大多数cccDNA分子而言，游离分子而言，游离EB的临界浓度介于的临界浓度介于0.10.5g/ml。由于电荷的中和，以及由于电荷的中和，以及EB赋予赋予DNA较大的刚性，较大的刚性，随着随着EB浓度的增加，浓度的增加，linearDNA和和ocDNA的迁移速率也有的迁移速率也有不同程度的减小。不同程度的减小。第十九页，讲稿共七十一页哦大分子DNA的电泳分离 在常规琼脂糖凝胶电泳中，有效分离天然在常规琼脂糖凝胶电泳中，有效分离天然DNA分子的分子的大小最大只能到大小最大只能到1520kb。更大的线状双链。更大的线状双链DNA分

19、子分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率相同。此时凝胶不能再按分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率相同。此时凝胶不能再按分子大小分离大小分离DNA，DNA分子像通过弯管一样，以其一端指分子像通过弯管一样，以其一端指向电场的一极而通过凝胶，这种迁移模式谓之向电场的一极而通过凝胶，这种迁移模式谓之“爬行爬行”。第二十页，讲稿共七十一页哦脉冲电泳 1983年，年，Schwartz等提出了脉冲电场凝胶电泳的设等提出了脉冲电场凝胶电泳的设计思想，从而找到了解决这一问题的办法。这一方法在凝计思想，从而找到了解决这一问题的办法。这一方法在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场

20、方向改变后，大DNA分子便滞留在爬行管里，直至沿新的电场轴向重新定分子便滞留在爬行管里，直至沿新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。向后，才能继续向前移动。若若DNA分子变换方向的时间小分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，于电脉冲周期时，DNA分子就可以按其大小分开。分子越大分子就可以按其大小分开。分子越大，转向所需的时间越长，总的迁移距离就越短，从而达到分离，转向所需的时间越长，总的迁移距离就越短，从而达到分离的目的。的目的。第二十一页，讲稿共七十一页哦交变脉冲垂直定向电场电泳 Schwartz和和Cantor（1984）最先设计的脉冲电场凝）最先设计的脉冲电场凝胶电泳装置采用了交变脉冲

21、垂直定向电场和线电极。胶电泳装置采用了交变脉冲垂直定向电场和线电极。non-uniform field（200V）in the N-S directionuniform field（85V）in the E-W direction第二十二页，讲稿共七十一页哦电场倒转凝胶电泳，FIGE Carle等（等（1986）设计的装置为利于单个电场的周期性）设计的装置为利于单个电场的周期性倒转（电场倒转凝胶电泳，倒转（电场倒转凝胶电泳，field-inversion gel electrophoresis，FIGE），舍弃了正交排列的两个电场），舍弃了正交排列的两个电场。电场在两个方向上都是均一的，而正向

22、脉冲稍长于反向。电场在两个方向上都是均一的，而正向脉冲稍长于反向脉冲，从而导致了脉冲，从而导致了DNA沿相当笔直的轨迹运动。应用微沿相当笔直的轨迹运动。应用微处理机增加电泳时脉冲的绝对长度并保持正反象脉冲的处理机增加电泳时脉冲的绝对长度并保持正反象脉冲的比例不变，可以使分辨力达到最大。比例不变，可以使分辨力达到最大。FIGE可分辨长达可分辨长达2000kb的的DNA片段。片段。10.5V/cm，/Xho两个片段，两个片段，15kb和和33.5kb，在正，在正向向0.5sec，反向，反向0.25sec分得很开；分得很开；T5 125kb，T4 170kb，在正向，在正向3sec，反向，反向1se

23、c分得很开。分得很开。第二十三页，讲稿共七十一页哦电场倒转凝胶电泳的分离效果第二十四页，讲稿共七十一页哦垂直凝胶脉冲电泳 Gardiner等（等（1986）使用的是垂直凝胶装置，铂）使用的是垂直凝胶装置，铂丝电极装在凝胶的两个对边上。丝电极装在凝胶的两个对边上。DNA先向一组电极移动先向一组电极移动，电场转换后则向另一组电极移动。这种，电场转换后则向另一组电极移动。这种“之之”字形运动字形运动的净结果是从加样孔指向凝胶底部的直线。由于凝胶中的的净结果是从加样孔指向凝胶底部的直线。由于凝胶中的所有泳道均处在相同的电场下，所以所有泳道均处在相同的电场下，所以DNA的条带不会发生的条带不会发生水平变

24、形。这种系统的分辨上限大约为水平变形。这种系统的分辨上限大约为9000kb。第二十五页，讲稿共七十一页哦钳位均匀电场脉冲电泳 钳位均匀电场电泳（钳位均匀电场电泳（CHEF）中，由多个在水平凝胶的）中，由多个在水平凝胶的周围沿正方形或六边形排列的电极产生电场，这些电极都被钳周围沿正方形或六边形排列的电极产生电场，这些电极都被钳制在预定的电位上。正方形排列的电极产生的电场互成制在预定的电位上。正方形排列的电极产生的电场互成90，六边形排列的电极产生的电场虽凝胶的位置和电极极性，六边形排列的电极产生的电场虽凝胶的位置和电极极性的不同而互成的不同而互成120或或60。结合运用低电场强度（。结合运用低电

25、场强度（1.3V/cm）、低浓度琼脂糖（）、低浓度琼脂糖（0.6%）、延长转换间隔（）、延长转换间隔（1小时）和延长电泳时间（小时）和延长电泳时间（130小时）等条件，有可能分离小时）等条件，有可能分离长达长达5000kb的的DNA分子。分子。第二十六页，讲稿共七十一页哦钳位均匀电场电泳的电极分布（CHEF）第二十七页，讲稿共七十一页哦物理图谱的定义 标明限制性内切酶在标明限制性内切酶在DNA分子上的切割位点和切割分子上的切割位点和切割位点间距离的图谱，称为位点间距离的图谱，称为DNA的物理图谱，又叫限制性图的物理图谱，又叫限制性图谱。谱。第二十八页，讲稿共七十一页哦图图51 多限制酶多限制酶

26、消化法制消化法制作物理图作物理图谱谱第二十九页，讲稿共七十一页哦图图52 部分消化法制作物理图谱部分消化法制作物理图谱 A D D D B0.5 2.2 1.3 1.032 P5.0 kb4.02.70.5第三十页，讲稿共七十一页哦DNA聚合酶的性质酶酶35外外切酶切酶53外切酶外切酶聚合反应聚合反应速率速率持续合成持续合成能力能力大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶低低有有中中低低大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶大片段（大片段（Klenow酶）酶）低低无无中中低低逆转录酶逆转录酶无无无无低低中中T4 DNA聚合酶聚合酶高高无无中中低低天然天然T7 DNA聚合酶聚合酶高高无无高高高高化学修饰化

27、学修饰T7 DNA聚合酶聚合酶（测序酶）（测序酶）低或无低或无无无高高高高Taq DNA聚合酶聚合酶无无有有高高高高第三十一页，讲稿共七十一页哦测序酶 化学修饰化学修饰T7 DNA聚合酶是将天然聚合酶是将天然T7 DNA聚合酶与聚合酶与O2、低浓度的、低浓度的Fe 2+一起保温数天，修饰一起保温数天，修饰T7 DNA聚合酶的聚合酶的N端结构域，使其丧失端结构域，使其丧失99%以上的以上的35外切酶活性，外切酶活性，而聚合酶活性不受影响，称为测序酶（而聚合酶活性不受影响，称为测序酶（sequenase）。后来又发展出了基因工程手段产生出一种改进的测。后来又发展出了基因工程手段产生出一种改进的测序

28、酶（测序酶序酶（测序酶2.0版），它完全丧失了版），它完全丧失了35外切酶活外切酶活性。性。第三十二页，讲稿共七十一页哦DNA聚合酶的聚合酶的53聚合酶活性聚合酶活性第三十三页，讲稿共七十一页哦切口平移标记核酸探针 带有易带有易检测标记的、已知其序列或来源的检测标记的、已知其序列或来源的DNA片段称片段称为探针。探针的用途是通过碱基互补探寻能够与之杂交的为探针。探针的用途是通过碱基互补探寻能够与之杂交的未知未知DNA片段片段。先用先用DNase（牛胰）轻微作用于（牛胰）轻微作用于DNA（在（在Mg 2+存存在下），在双链在下），在双链DNA上产生一些切口，然后用大肠杆上产生一些切口，然后用大肠

29、杆菌菌DNA聚合酶聚合酶及及4种种dNTP（其中（其中1种带有种带有32P标记）进标记）进行切口平移标记。此法利用的是该酶的聚合酶活性和行切口平移标记。此法利用的是该酶的聚合酶活性和53外切酶活性。外切酶活性。第三十四页，讲稿共七十一页哦图图54 切口平移法制备切口平移法制备32P标记的探针标记的探针第三十五页，讲稿共七十一页哦Klenow片段的产生 用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶，得到得到C端端70%的分子量为的分子量为76 kD的片段，称为的片段，称为Klenow片段片段。Klenow fragment 具有聚合酶活性和具有聚合酶活性

30、和35外切酶活性外切酶活性，没有，没有53外切酶活性。外切酶活性。53外切酶活性位于全外切酶活性位于全酶酶N端分子量为端分子量为36 kD的小片段中。现已用基因工程的方法直的小片段中。现已用基因工程的方法直接生产接生产Klenow片段（片段（Klenow酶）。酶）。第三十六页，讲稿共七十一页哦随机引物标记法制备探针 先使待标记的双链先使待标记的双链DNA变性成单链，再与变性成单链，再与6bp长的随机长的随机引物混合物一起退火，加引物混合物一起退火，加Klenow酶和酶和4种种dNTP（其中（其中1种带种带有有32P标记）合成模板的互补链。互补链从引物的标记）合成模板的互补链。互补链从引物的3端

31、延端延伸。伸。第三十七页，讲稿共七十一页哦图图55 采用采用Klenow酶的随机引物标记法酶的随机引物标记法第三十八页，讲稿共七十一页哦逆转录酶 已经商品化的逆转录酶有两种：一种是来自禽成髓细胞瘤已经商品化的逆转录酶有两种：一种是来自禽成髓细胞瘤病毒（病毒（avian myeloblastosis virus,AMV），称为禽源逆），称为禽源逆转录酶。它包括两条多肽链，转录酶。它包括两条多肽链，链链65kD，链链95kD，具有逆，具有逆转录活性及很强的转录活性及很强的RNaseH活性（降解活性（降解DNA:RNA杂交双链中杂交双链中的的RNA）。另一种是从一株能表达克隆化的）。另一种是从一株能

32、表达克隆化的Moloney鼠白鼠白血病病毒（血病病毒（mouse leucocytosis virus,Mo-MLV）逆转录酶）逆转录酶基因的大肠杆菌中分离得到的，称为鼠源逆转录酶。它是基因的大肠杆菌中分离得到的，称为鼠源逆转录酶。它是分子量为分子量为84kD的单链蛋白，具有逆转录活性和相对较弱的的单链蛋白，具有逆转录活性和相对较弱的RNaseH活性。活性。第三十九页，讲稿共七十一页哦逆转录酶 由于由于RNaseH活性对活性对RNA模板有破坏作用，因此禽模板有破坏作用，因此禽源逆转录酶制剂中高水平的源逆转录酶制剂中高水平的RNaseH活性往往趋向于抑制活性往往趋向于抑制cDNA的产量，并限制的

33、产量，并限制cDNA合成的长度。然而，与鼠合成的长度。然而，与鼠源逆转录酶相比，禽源逆转录酶能更有效地拷贝较复杂源逆转录酶相比，禽源逆转录酶能更有效地拷贝较复杂的的mRNA。第四十页，讲稿共七十一页哦T4 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶与聚合酶与Klenow酶相似，它们都具有酶相似，它们都具有53聚合酶活性及聚合酶活性及35外切酶活性，而且外切酶活性，而且35外切酶活性对单链外切酶活性对单链DNA的作用比对双链的作用比对双链DNA更强。更强。T4 DNA聚合酶的外切核酸酶活性要比聚合酶的外切核酸酶活性要比Klenow酶强酶强200倍。倍。第四十一页，讲稿共七十一页哦T4 DNA聚合酶 T4

34、DNA聚合酶用于补平或标记限制酶消化聚合酶用于补平或标记限制酶消化DNA后产生后产生的的3凹端，还用于对带有凹端，还用于对带有3突出端的突出端的DNA分子进行末分子进行末端标记。（先切端标记。（先切3突出端成凹端，再补上。这一从凹端或突出端成凹端，再补上。这一从凹端或平端上循环往复地去除和加上平端上循环往复地去除和加上3端核苷酸的反应又称为置端核苷酸的反应又称为置换反应。）换反应。）第四十二页，讲稿共七十一页哦末端脱氧核苷酸转移酶催化的反应（同聚物加尾）（同聚物加尾）末端脱氧核苷酸转移酶是从小牛胸腺中纯化出来的一种末端脱氧核苷酸转移酶是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量（小分子量（34kD）的

35、碱性蛋白质，由一个）的碱性蛋白质，由一个26kD的大亚基和的大亚基和一个一个8kD的小亚基组成。底物是的小亚基组成。底物是dNTP和具有和具有3羟基的单链羟基的单链DNA或具有或具有3羟基突出末端的双链羟基突出末端的双链DNA。此酶简称末端转。此酶简称末端转移酶。它将移酶。它将dNTP加到加到3末端羟基上，可用来加多聚核末端羟基上，可用来加多聚核苷酸尾。苷酸尾。第四十三页，讲稿共七十一页哦碱性磷酸酶 催化单链或双链催化单链或双链DNA、RNA 5端的磷酸基团水解，端的磷酸基团水解，成为成为5OH。它也能催化。它也能催化NTP和和dNTP 5磷酸的水解。磷酸的水解。第四十四页，讲稿共七十一页哦两

36、种碱性磷酸酶 有两种碱性磷酸酶，即来自大肠杆菌的细菌碱性磷有两种碱性磷酸酶，即来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（酸酶（BAP）和小牛肠碱性磷酸酶（）和小牛肠碱性磷酸酶（CIP）。）。CIP在在SDS中加热至中加热至68可完全失活，而可完全失活，而BAP对去垢剂和高温的耐受性对去垢剂和高温的耐受性更强，不便于反应后除去酶活性。用更强，不便于反应后除去酶活性。用CIP催化的反应一般在催化的反应一般在pH9.3进行。进行。第四十五页，讲稿共七十一页哦碱性磷酸酶的用途碱性磷酸酶用于：碱性磷酸酶用于：DNA或或RNA 5端标记端标记32P时，除去原有的时，除去原有的5磷酸；磷酸；除去载体除去载体DNA的的5

37、磷酸以防自身连接，而不影响磷酸以防自身连接，而不影响带有带有5磷酸的外源磷酸的外源DNA片段与载体的连接。片段与载体的连接。第四十六页，讲稿共七十一页哦T4 多核苷酸激酶 T4多核苷酸激酶催化的前向反应（正向反应）是将多核苷酸激酶催化的前向反应（正向反应）是将ATP的的磷酸转移到磷酸转移到DNA或或RNA的的5OH上，用于标记上，用于标记5端（用端（用32PATP）。铵离子和磷酸是此反应的抑制剂，所以）。铵离子和磷酸是此反应的抑制剂，所以应该用应该用Tris缓冲液（缓冲液（pH7.48.0）。）。该酶还可以在高浓度该酶还可以在高浓度ATP和和ADP存在下催化交换反应存在下催化交换反应，使，使A

38、TP的的磷酸与磷酸与DNA、RNA 5端的磷酸基团交换端的磷酸基团交换。此反应的首选反应缓冲液是咪唑缓冲液（。此反应的首选反应缓冲液是咪唑缓冲液（pH6.4）。此）。此法标记效率较低，不如正向反应常用。法标记效率较低，不如正向反应常用。第四十七页，讲稿共七十一页哦T4 多核苷酸激酶催化的反应第四十八页，讲稿共七十一页哦大肠杆菌DNA连接酶的特点 大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶可催化含互相匹配的连接酶可催化含互相匹配的5突出端或突出端或3突出端的双链突出端的双链DNA之间形成磷酸二酯键，还可催化切口之间形成磷酸二酯键，还可催化切口的连接。该反应需要的连接。该反应需要NAD+参与催化，还需要参与催化

39、，还需要ATP和和Mg 2+。最初的研究表明，该酶不能催化平端双链最初的研究表明，该酶不能催化平端双链DNA间的连接，但间的连接，但随后发现，在聚乙二醇或随后发现，在聚乙二醇或Ficoll（聚蔗糖）的存在下，该酶能（聚蔗糖）的存在下，该酶能催化平端的连接。催化平端的连接。大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶不能连接连接酶不能连接RNA。第四十九页，讲稿共七十一页哦DNA连接酶催化的反应第五十页，讲稿共七十一页哦T4 DNA连接酶的特点 T4 DNA连接酶为一分子量为连接酶为一分子量为68kD的蛋白，它催化互补的蛋白，它催化互补粘性末端的连接或切口的连接。它还可以催化平端的连接，粘性末端的连接或切口的连

40、接。它还可以催化平端的连接，连接平头末端所需的酶量为连接粘性末端的连接平头末端所需的酶量为连接粘性末端的1020倍。加入倍。加入150200mmol/L的的NaCl及低浓度的及低浓度的PEG可大大提高平端连可大大提高平端连接的速率。接的速率。T4 DNA连接酶催化连接反应也需要连接酶催化连接反应也需要ATP和和Mg2+。37有利于有利于DNA连接酶的活性，但对粘性末端的结合来连接酶的活性，但对粘性末端的结合来说温度太高，两者折衷，一般以说温度太高，两者折衷，一般以415下进行连接反应为宜下进行连接反应为宜。第五十一页，讲稿共七十一页哦T4 RNA连接酶 T4 RNA连接酶催化单链连接酶催化单链

41、DNA或或RNA与另一单链与另一单链DNA或或RNA连接。连接。第五十二页，讲稿共七十一页哦S1核酸酶（米曲霉）S1核酸酶是单链内切酶，切割单链核酸酶是单链内切酶，切割单链DNA或或RNA，产，产生带生带5磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。双链磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。双链DNA、双链、双链RNA及及DNA:RNA杂交体对此酶相对不敏感，但如果所用杂交体对此酶相对不敏感，但如果所用S1核酸核酸酶的酶量非常大，则双链核酸可被完全消化。中等量的酶的酶量非常大，则双链核酸可被完全消化。中等量的S1核核酸酶可在缺口或切口处作用（第二式）。该酶在酸性条件酸酶可在缺口或切口处作用（第二式）。该酶在酸性条件下作用，

42、以下作用，以Zn2+为活化剂。为活化剂。第五十三页，讲稿共七十一页哦Bal 31核酸酶（Alteromonas espejiana Bal 31）Bal 31核酸酶既是单链内切酶，与核酸酶既是单链内切酶，与S1核酸酶有同样的核酸酶有同样的作用，又是双链外切酶，可以从双链作用，又是双链外切酶，可以从双链DNA的两端有节制地的两端有节制地降解双链降解双链DNA，产生缩短的双链，产生缩短的双链DNA。后一功能可用于产。后一功能可用于产生不同缺失程度的突变体。生不同缺失程度的突变体。第五十四页，讲稿共七十一页哦Bal31核酸酶催化的反应第五十五页，讲稿共七十一页哦 DNase（牛胰）DNA内切酶，内切

43、酶，Mg 2+存在时可在双链存在时可在双链DNA上造成随机切上造成随机切口，口，Mn2+存在时可在两条链的大致同一位置上切割存在时可在两条链的大致同一位置上切割DNA，产，产生平端生平端DNA片段，或产生只带有片段，或产生只带有12个核苷酸单链突出的片个核苷酸单链突出的片段。段。第五十六页，讲稿共七十一页哦外切酶（大肠杆菌）此酶从双链此酶从双链DNA的两个的两个3端逐个切下核苷酸，可作端逐个切下核苷酸，可作用于平端及用于平端及3凹端的双链凹端的双链DNA，不作用于单链，不作用于单链DNA及带及带有有3突出端的双链突出端的双链DNA。该酶持续作用不强，因此产物。该酶持续作用不强，因此产物一般为一

44、个被切割程度不相上下的一般为一个被切割程度不相上下的DNA分子集群。分子集群。第五十七页，讲稿共七十一页哦分子杂交 用带有标记的已知核酸片段（称为探针）与变性的未用带有标记的已知核酸片段（称为探针）与变性的未知核酸退火配对的过程就是分子杂交。杂交有知核酸退火配对的过程就是分子杂交。杂交有DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。通过分子杂交可以在许杂交。通过分子杂交可以在许多不同核酸片段中寻找或探测出特定的核酸片段。多不同核酸片段中寻找或探测出特定的核酸片段。第五十八页，讲稿共七十一页哦印 迹 分子杂交中的印迹，是将核酸分子从凝胶或细胞中转移到分子杂交中的印迹，是将核酸分子从凝胶或细

45、胞中转移到膜上的过程。杂交必须在膜上进行，所以电泳分离的核酸或培膜上的过程。杂交必须在膜上进行，所以电泳分离的核酸或培养基上的菌落或噬菌斑必须先印迹到膜上。常用的膜有硝酸纤养基上的菌落或噬菌斑必须先印迹到膜上。常用的膜有硝酸纤维素膜（维素膜（nitrocellulose filter membrane，NC膜）和尼龙膜）和尼龙（nylon）膜。）膜。NC膜结合能力较强，杂交信号本底较低，缺膜结合能力较强，杂交信号本底较低，缺点是膜质脆易破，高温下结合核酸分子不够牢固。尼龙膜结点是膜质脆易破，高温下结合核酸分子不够牢固。尼龙膜结合能力比合能力比NC膜强，柔性好可反复使用，但有时杂交信号本底较膜强

46、，柔性好可反复使用，但有时杂交信号本底较高。高。第五十九页，讲稿共七十一页哦分子杂交Southern 印迹印迹Northern 印迹印迹斑点印迹和狭线印迹斑点印迹和狭线印迹印迹种类杂交种类滤膜杂交滤膜杂交原位杂交原位杂交 菌落或噬菌斑原位杂交菌落或噬菌斑原位杂交 组织、细胞空间定位原位杂交组织、细胞空间定位原位杂交第六十页，讲稿共七十一页哦Sothern 杂交 Sothern blotting是是1975年由年由Southern建立并以他的建立并以他的名字命名的一种名字命名的一种DNA转移方法。其基本方法是先将待测转移方法。其基本方法是先将待测DNA进行琼脂糖凝胶电泳，使进行琼脂糖凝胶电泳，使

47、DNA按片段大小分开成带，按片段大小分开成带，再用再用NaOH溶液处理电泳后的凝胶，使其中的溶液处理电泳后的凝胶，使其中的DNA变性成变性成单链，然后通过毛细作用将单链单链，然后通过毛细作用将单链DNA转移到硝酸纤维素膜转移到硝酸纤维素膜（NC膜）或尼龙膜上，膜晾干后在膜）或尼龙膜上，膜晾干后在80（真空）烘烤（真空）烘烤2小时，使核酸片段结合得更牢固，再用标记探针去杂交，小时，使核酸片段结合得更牢固，再用标记探针去杂交，通过放射自显影或其他显色方法找出杂交带。通过放射自显影或其他显色方法找出杂交带。第六十一页，讲稿共七十一页哦Southern 印迹第六十二页，讲稿共七十一页哦Southern

48、杂交过程 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱变性碱变性中和中和印迹到膜上印迹到膜上80（真空）烘烤（真空）烘烤2小时小时预杂交预杂交杂交杂交显带显带 尼龙膜可用毛细管转移和电转移，还可以用真空转移尼龙膜可用毛细管转移和电转移，还可以用真空转移装置进行真空转移。在以尼龙膜为固相载体时，采用双链装置进行真空转移。在以尼龙膜为固相载体时，采用双链DNA转移到膜上后再碱变性。转移到膜上后再碱变性。第六十三页，讲稿共七十一页哦Northern印迹 将将RNA进行变性和凝胶电泳后，转移到膜上的过程称进行变性和凝胶电泳后，转移到膜上的过程称为为Northern blotting。此法的基本原理与。此法的基本原理

49、与Southern blotting相同，只是不能采用碱变性，因为碱会破坏相同，只是不能采用碱变性，因为碱会破坏RNA。RNA的分离采用变性凝胶电泳，变性剂为甲醛或乙二醛。提取、的分离采用变性凝胶电泳，变性剂为甲醛或乙二醛。提取、纯化和分离纯化和分离RNA容易受到容易受到RNase的破坏，的破坏，RNase耐高温，耐高温，100煮沸不能灭活煮沸不能灭活RNase。实验所用的容器、试剂可用高。实验所用的容器、试剂可用高压灭菌、焦碳酸二乙酯（压灭菌、焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）处理、）处理、试剂中加入试剂中加入RNase抑制剂、戴手套等排除抑制剂、戴手套等排除RNase

50、的破坏的破坏作用。作用。第六十四页，讲稿共七十一页哦斑点印迹和狭线印迹 将变性后的样品不经分离，采用抽真空的方法将加在将变性后的样品不经分离，采用抽真空的方法将加在多孔加样器上的核酸样品直接转移到膜上，再行杂交。此法多孔加样器上的核酸样品直接转移到膜上，再行杂交。此法主要用于定量，如基因的表达丰度（测某种主要用于定量，如基因的表达丰度（测某种mRNA的量）的量）。第六十五页，讲稿共七十一页哦滤膜杂交 为了减少探针的非特异性结合，降低背景，使杂交条带为了减少探针的非特异性结合，降低背景，使杂交条带清晰，必须先行预杂交。预杂交液中含有经变性并断裂成片清晰，必须先行预杂交。预杂交液中含有经变性并断裂