分子荧光分析法 (2)课件.ppt

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1、关于分子荧光分析法(2)现在学习的是第1页，共44页一、概述一、概述1 光致发光光致发光：当某些物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光之外还发射波长相同或比吸收波长更长的光，这种现象叫光致发光。荧光 fluorescence:物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级返回至基态时发射出的光。磷光 phosphorescence:吸收光子 激发 三线态最低 振动能级 基态现在学习的是第2页，共44页 2 2 荧光分析方法荧光分析方法 Fluorometry 根据物质的荧光谱线位置及其强度进行 物质鉴定和物质含量测定的方法。X射线荧光分析法 X-ray fluorometry 原子荧

2、光分析法 atomic fluorometry 分子荧光分析法 molecular fluorometry 3.3.优点：优点：灵敏度高，选择性好。mlgmlg/12101010/710荧光分析法检出限为可见分光光度法检出限紫外现在学习的是第3页，共44页 二二 基本原理基本原理 1 1 有关概念有关概念 单线态单线态：大多数分子含偶数个电子，成对地填充 在能量最低的各轨道中，根据Pauli不相 容原理，轨道中的两个电子具有相反方 向的自旋，即自旋量子数为+1/2和-1/2，其总自旋量子数为0。用2S+1表示电子 能态的多重性，基态所处的电子能态为 单线态。现在学习的是第4页，共44页 当基态

3、分子的一个电子吸收光辐射被激发而跃迁至较高的电子能级时，电子不发生自旋方向的改变，此时分子处于激发的单线态。激发三线态激发三线态：电子在跃迁过程中自旋方向改变，分子具有两个自旋不配对的电子，总自旋量子数为1，处于激发的三线态（2S+1=3）。2 2 基态、激发单线态、激发三线态比较 如图所示，激发三线态和激发单线态现在学习的是第5页，共44页 除电子自旋方向改变外，能量亦不相同。E 基态 激发单线态 激发三线态 现在学习的是第6页，共44页3 荧光的产生 荧光的产生过程：基态吸收辐射 激发单线态 内转换、振动驰豫 第一激发单线态的最低振动能级 发射荧光 基态的各振动能级外转换、振动驰豫 基态的

4、最低振动能级现在学习的是第7页，共44页 荧光与磷光产生示意图0V1V2V3V0V1V2V3V3V3V1V1V2V2V0V0V0S1S2S1T内转换体系间跨越现在学习的是第8页，共44页 发射荧光过程约为 ，返回基态 时，可停留在任一振动能级上，因此，可得几个非常靠近的荧光峰谱线。有关概念：有关概念：振动弛豫：vbrational relexation 物质分子被激发后，其电子可能跃迁到第一电子激发态或更高的电子激发态的几个振动能级上，在溶液中，激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级上，此过程称为。S710910现在学习的是第9页

5、，共44页 内转换：internal conversion 当两电子激发态之间能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子将多余的能量转变为热能而跃迁至较低电子能级。荧光发射：无论分子最初处于哪一个激发单线态，通过内转换及振动弛豫，均可返回至第一激发单线态的最低振动能级上，然后再以辐射形式发射光量子而返回到基态的任一振动能级上，所发射的光量子即 称荧光荧光。现在学习的是第10页，共44页 荧光的波长总比激发光的波长要长?外转换：external conversion 如果分子在溶液中被激发，激发态分子与溶剂分子及其它溶质分子之间相互碰撞而失去能量，以热能形式放出，此过程称为外转换。通常发生在第

6、一激发单线态或第一激发三线态的最低振动能级向基态转换的过程中，会降低荧光或磷光强度。现在学习的是第11页，共44页 体系间跨越：intersystem crossing 指处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。如果第一激发单线态的最低振动能级同激发三线态的最高振动能级重叠，那么激发态分子的电子发生自旋反转，分子由激发单线态跨越到激发三线态，荧光强度减弱或熄灭。含有重原子如Br2、I2等的分子，体系间跨越最常见，因为电子的自旋与轨道运动之间的相互作用较大，有利于电子自反转的发生。溶液中存在的氧分子等顺磁性物质也容易发生体系间跨越，从而使荧光减弱。现在学习的是第12页，共

7、44页 磷光发射：激发单线态最低振动能级体系间跨越激发 三线态高振动能级 振动驰豫 激发三线态 最低振动能级（存活）发射磷光 基态 各振动能级振动驰豫、外转换基态最低振动能级 与荧光比较：过程比荧光长（）磷光波长较荧光长?S10104现在学习的是第13页，共44页 综上所述的能量释放方式中：辐射跃迁：荧光、磷光的发射。无辐射跃迁：振动弛豫、内转换、外转换、体系间跨越。现在学习的是第14页，共44页三、激发光谱与发射光谱三、激发光谱与发射光谱1激发光谱激发光谱：excitaton spectrum 不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。即固定荧光波长，以荧光强度（F）为纵坐标，激

8、发波长（ex）为横坐标作图可得。2 发射光谱发射光谱：fluorescence spectrum 即荧光光谱，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度（F）对发射波长（em）的关系曲线。现在学习的是第15页，共44页 作用：鉴别荧光物质；选择适当的荧光测定波长。激发光谱和荧光光谱类似“镜像对称”关系 硫酸奎宁的激发光谱（虚线）及荧光光谱（实线）度强光荧nm300nm400nm500现在学习的是第16页，共44页 3 溶液荧光光谱的特征A 斯托克斯位移：Stokes shift 1852年，Stokes首先观察到：溶液荧光光谱中，荧光波长总是大

9、于激发光波长。原因原因：内转换、振动驰豫达到第一激发单线态的最低振动能级；激发态分子与溶剂相互作用；激发态分子返回到基态的各不同振动能级，进一步损失能量。B 荧光光谱的形状与激发波长无关：荧光发射通常发生于第一电子激发态的最低振动能级；而与激发到哪一个电子激发态无关。现在学习的是第17页，共44页四四 分子结构与荧光的关系分子结构与荧光的关系 物质能否产生荧光，主要取决于物质结构及环境条件。1 物质产生荧光的必要条件 物质分子必须有强的紫外-可见吸收。物质必须具有较高的荧光效率。荧光效率（fluorescence efficiency）又称荧光量子产率（fluorescence quantum

10、 yield）吸收激发光的光子数发射荧光的光子数现在学习的是第18页，共44页 任何物质的 在01之间，如荧光素在水中 =0.65，蒽在乙醇中 =0.30，菲在乙醇中 =0.10。荧光效率低的物质虽有较强的紫外吸收，但所吸收的能量都以无辐射跃迁形式释放，所以没有荧光发射。2 与分子结构的关系 A A 长共轭结构长共轭结构：芳香环或杂环具有长共轭的跃 *跃 迁，电子共轭程度越大，荧光强度越大，荧光波长长移。现在学习的是第19页，共44页例：苯、萘、蒽的荧光强度比较。205nm 286nm 356nm 278nm 321nm 404nm 0.11 0.29 0.36 B 分子的刚性和共平面性分子的

11、刚性和共平面性 刚性：指分子自由旋转程度的大小，若分子不能旋转，则为刚性分子。共平面性:指共扼电子的共平面程度。在长共轭分子中，刚性和共平面性越大，荧光效率越大，荧光波长长移。exem现在学习的是第20页，共44页 联苯 芴C 取代基取代基：增加分子的电子共轭程度的取代基,增强荧光，并使波长长移；减弱分子的电子共轭程度的取代基，使荧光减弱或熄灭。第一类基团：-NH2、-OH、-OCH3、-CN等，属于给电子基团，增强荧光。2.00.12Hc现在学习的是第21页，共44页 第二类基团：-COOH、-NO2、-NO、-Cl-Br、-I等，减弱分子的电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。第三类基团：-R、

12、-SO3H等 对荧光的影响不明显。五 影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素1 温度：温度越高，荧光效率及荧光强度越低。因为温度升高，分子运动速度加快，分子间碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加，降低了荧光效率。现在学习的是第22页，共44页 2 溶剂：一般情况下，荧光波长随溶剂极性增大而长移，强度也有所增加。荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。溶剂粘度减小时，可增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而使荧光减弱。若溶剂与荧光物质形成化合物或溶剂使荧光物质的电离状态改变，那么，荧光峰的波长和荧光强度将发生变化。3 pH的影响：每种荧光物质都有最适宜的pH范围现在学习的是第23页，共44页 如：苯胺在

13、不同的pH下的荧光效率不同。pH 2 pH712 pH13 无荧光 蓝色荧光 无荧光4 荧光熄灭剂的影响：荧光熄灭：指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。荧光熄灭剂：能够引起荧光熄灭的物质。3NH2NHNHOHOHHH现在学习的是第24页，共44页 如：X离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物。五种形式:荧光物质的分子和熄灭剂分子发生碰撞而损失能量。荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成本身不发光的配位化合物。荧光物质分子中引入溴或碘后易发生体系间跨越而转变至三线态。现在学习的是第25页，共44页 溶解氧的存在使荧光物质氧化或由于氧分子的顺磁性促

14、进了体系间跨越，使激发单线态的荧光分子转变至三线态，从而引起荧光熄灭现象。荧光自熄灭现象：当荧光物质浓度较高时，由于荧光分子间碰撞几率增加而损失能量，使荧光熄灭。荧光熄灭法：利用一个荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的减小和荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，可以测定荧光熄灭剂的含量。现在学习的是第26页，共44页 6 散射光的干扰 散射光主要有瑞利光和拉曼光两种：瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞时，不发生能量的交换，仅是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞时,光子运动方向发生改变，能量交换，发射光比入射光波长稍长或稍短的光。散射光对荧光测定有干扰，尤

15、其是波长比入射光波长更长的拉曼光，因其波长与荧光波长接近，对荧光测定的干扰更大。现在学习的是第27页，共44页 硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱360350448硫酸奎宁激发nm35035040042/1.0350SOLHmolnm激发320448硫酸奎宁激发nm320a度强32036042/1.0320SOLHmolnm激发b度强现在学习的是第28页，共44页 无论选择320或350nm为激发光，荧光峰总在448nm，拉曼光波长分别为360和400nm，其中，400nm的拉曼光对荧光的测定有干扰。现在学习的是第29页，共44页 六 荧光分析仪器 用于测定荧光强度有滤光片荧光计、滤光片

16、-单色器荧光计及荧光分光光度计三种类型。第一种类型仪器不能测定光谱，可进行定量分析；第二种类型仪器不能测定激发光谱，但可测定荧光光谱；第三种类型仪器既可测定激发光谱，又可测定荧光光谱。现在学习的是第30页，共44页 1 荧光分光光度计 主要构造：激发光源 单色器 样品池 检测器系统光源激发单色器样品池质物光吸面表发射单色器检测器放大器指示器记录器荧光分光光度计结构示意图现在学习的是第31页，共44页 2 荧光分析仪器的校正 灵敏度校正 影响荧光分光光度计灵敏度的因素很多，与仪器的光源强度、单色器性能、光电管的灵敏度及放大系统的特征有关；与波长、狭缝宽度有关；还与被测定的容器、溶剂等的杂散光有关

17、。因此，同一型号的仪器，甚至同一台仪器在不同时间操作，所测得的结果也不尽相同。故使用前需进行灵敏度校正。现在学习的是第32页，共44页 一般地，在每次测定时，在选定波长及狭缝宽度的条件下，先用一种稳定的荧光物质配成浓度一定的标准溶液进行校正，将每次测得的荧光强度调节到相同数值（50%或100%）。通常在紫外-可见光范围内用1ug/ml的硫酸奎宁标准溶液（0.05mol/L的硫酸中）进行校正，因其产生的荧光十分稳定。波长校正 若仪器的光学系统或检测器有变动，或在较长使用时间之后，或在重要部件更换之后，可用汞灯的标准谱线对单色器波长刻度重新校正。现在学习的是第33页，共44页 激发光谱和荧光光谱的

18、校正 测得的激发光谱和荧光光谱往往是表观的，其原因较多，最主要原因是光源的强度随波长而变及每个检测器对不同波长的光的接受敏感程度不同，及检测器的感应与波长不呈线性。故应用仪器上的校正装置将每一波长的光源强度调整一致。现在学习的是第34页，共44页 七 定量分析方法 1 荧光强度和荧光物质浓度的关系 荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度 即：F（）F=代入上式后，展开得：0IIF0IIK（）0IIElCIIBeer100定律：根据现在学习的是第35页，共44页 由此可见：荧光强度与溶液中荧光物质浓度呈线性关系。荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度，即只要改进光电倍增管和放大系统，极微弱的荧光也能

19、被检测到，所以荧光分析法的灵敏度很高。KCElCIKFElCCElCElCElCIKF03203.205.033.223.23.2时，上式可变为：很小，当若浓度！）（！）（现在学习的是第36页，共44页 而紫外-可见分光光度法依据的是吸光度与吸光物质浓度的线性关系，所测定的是透射光强度和入射光强度的比值，即 ，因此，即使将光强信号放大，由于透射光强和入射光强都被放大，对提高检测灵敏度不起作用。故紫外-可见分光光度法的灵敏度不如荧 光分析法高。2 定量分析方法 与紫外-可见光度法基本相同。0II现在学习的是第37页，共44页 标准曲线法 即用已知量的标准物质经过和试样相同的处理之后，配成一系列标

20、准溶液，测定这些溶液的荧光强度，以荧光强度为纵坐标，标准浓度为横坐标，绘制标准曲线，然后在相同条件下测定试样溶液的荧光强度，由标准曲线求出荧光物质的含量。直接比较法 若标准曲线过原点，可采用此法。现在学习的是第38页，共44页 在相同条件下测定标准品和样品的荧光强度，由荧光强度比及标准品的浓度可求出待测物质的浓度。若空白溶液的荧光强度不为零，应扣除空白溶液的荧光强度。SXSXXSXSXXSSCFFFFCCCFFFFkkCFFkCFF000000为常数，则对同一物质而言，现在学习的是第39页，共44页 组分混合物的分析 a 各组分相互之间无显著干扰，可分别在不同波长处测各组分荧光强度。b 若不同

21、组分的荧光光谱相互重叠，则根据荧光强度的加和性质，在适宜波长处测混合物的荧光强度，解联立方程。八、应用八、应用 具有共轭体系的芳香族及具有芳香结构的化合物都可用荧光分析法测定，如多环胺类、萘酚类等。现在学习的是第40页，共44页 药物中的生物碱如：麻黄碱、吗啡等，甾体类、抗生素类、维生素类等。有些物质荧光很弱，可以与某些荧光试剂作用，得到强荧光产物。重要的荧光试剂：荧光胺：能与脂肪族或芳香族伯胺类形成高度荧光衍生物。邻苯二甲醛（OPA）：与伯胺类、氨基酸生成灵敏的荧光产物。现在学习的是第41页，共44页 丹酰氯：1二甲氨基5氯化磺酰萘，能与伯胺、仲胺及酚基的生物碱类反应生成荧光性物质。无机化合物的荧光分析无机化合物的荧光分析 大部分无机离子不显荧光，很多金属或非金属无机离子与具有电子共轭结构的有机化合物形成有荧光的配位化合物，故可测定。如：Al、Cu、Mg、S等二十几种离子。现在学习的是第42页，共44页 过渡金属离子不能形成荧光配合物。因为顺磁性，其激发单线态的电子易向激发三线态体系跨越，发生磷光。此外，形成的配合物能级很近，易发生内转换使分子失活。无机离子的测定需要借助一些有机荧光试剂。如：二苯乙醇酮、8-羟基喹啉、黄酮 醇等。现在学习的是第43页，共44页感谢大家观看感谢大家观看9/4/2022现在学习的是第44页，共44页