克隆基因的表达与产物纯化外源基因在真核细胞中的表达讲稿.ppt

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1、克隆基因的表达与产物克隆基因的表达与产物纯化外源基因在真核细纯化外源基因在真核细胞中的表达胞中的表达第一页，讲稿共九十二页哦酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。真核或病毒启动子 MCS PolyA信号 终止子外源基因第二页，讲稿共九十二页哦CONTENTS一、酵母基因工程二、昆虫培养细胞表达系统四、在哺乳动物细胞中表达三、外源基因在植物中表达第三页，讲稿共九十二页哦一、酵母基因工程n酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征n酵母菌的宿主系统n酵母菌的载体系统n酵母菌的转化系统n酵母菌的表达系统n利用重组酵母生产乙肝疫苗第四页，讲稿共九十二页哦酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的

2、单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌的分类学特征第五页，讲稿共九十二页哦酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉能将外源基因表达产物分泌至培养基中不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recogni

3、zed As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物第六页，讲稿共九十二页哦B 酵母菌的宿主系统 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌第七页，讲稿共九十二页哦广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（Schizosac

4、charomyces pombe）汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。第八页，讲稿共九十二页哦提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型突变类型 生物效应 作用位点Ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平ose1 提高重组蛋白表达 转录水平Ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Y rho-提高重组蛋白表达 转录水平第九页，讲稿共九十二页哦抑制超糖基化作用的

5、突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。突变类型 生物效应mnn 甘露糖生物合成缺陷型alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型Och 外侧糖链添加缺陷型能抑制超糖基化的突变类型第十页，讲稿共九十二页哦C 酵母菌的载体系统u 酵母菌中的野生型质粒u 酵母菌克隆表达质粒的构建第十一页，讲稿共九十二页哦酵母菌中的野生型质粒酿酒酵母中的2环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有几乎所有的酿酒酵

6、母中都含有22双链环状质粒，双链环状质粒，拷贝数达拷贝数达5050至至100100个。个。含有自主复制起始区（含有自主复制起始区（oriori）和）和STBSTB区，区，STBSTB序列能序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。够使质粒在供体细胞中维持稳定。2 plasmid 2 plasmid：从酵母菌天然的质粒上截取一：从酵母菌天然的质粒上截取一段包含复制序列的段包含复制序列的 2 DNA2 DNA。其特点是非常稳定，可确保細胞分裂时，质粒其特点是非常稳定，可确保細胞分裂时，质粒的性状可移交到子代中不会遺失。的性状可移交到子代中不会遺失。而且是而且是 high-copy numberhigh-

7、copy number的质粒。的质粒。第十二页，讲稿共九十二页哦酵母菌中的野生型质粒乳酸克鲁维酵母中的线状质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线状质粒pGKL1和pGKL1 拷贝数为50-100个，分别携带K1K2两种能使多种酵母菌致死的毒素蛋白编码基因（），同时含有毒素蛋白抗性基因。第十三页，讲稿共九十二页哦酵母菌克隆表达质粒的构建含有ARS的YRp质粒的构建ARS plasmid：从酵母菌的染色体中截取一段ARS element，ARS是表示Autonomously replicating sequence。ARS-containing plasmid的稳定性较差，质粒常被分解而无法代代

8、相传。但是若加入一段centromere(CEN)sequence(称CEN plasmid)，就可使质粒稳定性提高。但是其copy number较低，一般只有 single copy。第十四页，讲稿共九十二页哦酵母菌克隆表达质粒的构建含有ARS的YRp质粒的构建ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。以ARS为复制子的质粒称为YRp 以2质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒的丢失率

9、高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。第十五页，讲稿共九十二页哦酵母菌克隆表达质粒的构建含有CEN的YCp质粒的构建CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp（酵母着丝粒质粒）YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个第十六页，讲稿共九十二页哦酵母菌克隆表达质粒的构建含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。第十

10、七页，讲稿共九十二页哦D 酵母菌的转化系统 酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因第十八页，讲稿共九十二页哦酵母菌的转化程序 酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%第十九页，讲稿共九十二页哦酵母菌的转化程序 碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+

11、等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍共转化现象极为罕见第二十页，讲稿共九十二页哦酵母菌的转化程序 酵母菌电击转化法酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率可高达105/g DNA。第二十一页，讲稿共九十二页哦转化质粒在酵母细胞中的命运 单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制不

12、含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体 这对于体内定点突变酵母基因组极为有利克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80%第二十二页，讲稿共九十二页哦用于转化子筛选的标记基因营养缺陷型的互补基因用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA尿嘧啶等 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难第二十三页，讲稿共九十二页哦用于转化子筛选的标记基因显性标记基因显性标记基因的编码

13、产物只要是毒性物质的抗性蛋白标记基因 编码产物 遗传表型aph 氨基糖苷转移酶 抗G418cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素Dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺Cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂第二十四页，讲稿共九十二页哦E 酵母菌的表达系统 酵母菌启动子的可控性 外源基因在酵母菌中表达的限制因素 酵母菌表达系统的选择第二十五页，讲稿共九十二页哦酵母菌启动子的可控性 温度控制型启动子pho4TS-PHO5启动子：酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因

14、子PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35时失活因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35时关闭23诱导表达第二十六页，讲稿共九十二页哦酵母菌启动子的可控性 超诱导型启动子酿酒酵母的半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和GAL10 基因编码半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达第二十七页，讲稿共九十二页哦外源基因在酵母菌中表达的限制因素 外源基因稳态mRNA的浓度 外源基因mRNA的翻译活性 酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25个密码子编码的第二十八

15、页，讲稿共九十二页哦 酵母菌表达系统的选择酿酒酵母表达系统 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。第二十九页，讲稿共九十二页哦 酵母菌表达系统的选择乳酸克鲁维酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传4

16、0代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。第三十页，讲稿共九十二页哦 酵母菌表达系统的选择巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达

17、。第三十一页，讲稿共九十二页哦 酵母菌表达系统的选择多型汉逊酵母表达系统 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获得成功表达。第三十二页，讲稿共九十二页哦F 利用重组酵母生产乙肝疫苗 由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为H

18、BV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。第三十三页，讲稿共九十二页哦 乙型肝炎病毒的结构与性质 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母第三十四页，讲稿共九十二页哦乙型肝炎病毒的结构与性质 乙型肝炎病毒的结构 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染力的病毒。颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具

19、有糖基化结构和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。第三十五页，讲稿共九十二页哦乙型肝炎病毒的结构与性质 乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因第三十六页，讲稿共九十二页哦乙型肝炎病毒的结构与性质 传统乙肝疫苗的制备 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以

20、大规模产业化。第三十七页，讲稿共九十二页哦产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为22 nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对S抗原缺乏响应的人群的免疫反应。第三十

21、八页，讲稿共九十二页哦 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建第三十九页，讲稿共九十二页哦 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母重组巴斯德毕赤酵母的性能 由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%。在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。第四十页，讲稿共九十二页哦二、昆虫培养细胞

22、表达系统1.杆状病毒（Baculovirus）广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。（1）侵染周期：第四十一页，讲稿共九十二页哦第四十二页，讲稿共九十二页哦（2）杆状病毒的表达特点感染后36-48h，病毒开始合成大量的多角蛋白。多角蛋白的启动子特别强。多角蛋白基因可以被替换掉而不影响病毒的繁殖。第四十三页，讲稿共九十二页哦（3）杆状病毒载体转化过程 转移载体中插入外源基因 转移载体与野生型AcMNPV DNA共同转染宿主细胞 转移载体与病毒基因组发生双交换 外源基因被交换转入病毒基因组中 重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。第四十四页，讲稿共九十二页哦第四十五页，讲稿共九十二页哦第四十

23、六页，讲稿共九十二页哦2.最普遍应用的宿主细胞株3.转化子筛选 源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。通过显微镜检查看是否有多面体形成。第四十七页，讲稿共九十二页哦4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白第四十八页，讲稿共九十二页哦杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为“低成本蛋白工厂”。22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。5.杆状病毒大规模表达存在的问题（1）寿命短（2）共同转染率低感染4-5天后宿主细胞裂

24、解或幼虫死亡。重组率更低。0.1%-1%。第四十九页，讲稿共九十二页哦6.构建可持续表达的载体利用AcMNPV的一个早期基因IE1的启动子。IE1基因的转录不依赖于病毒的其他基因产物，而且在昆虫细胞中表达正常。把外源基因插入到IE1启动子和IE1终止子之间，构成整合型载体。载体转染宿主细胞后随即整合到宿主染色体上，实现外源蛋白的持续表达。载体 IE1启动子 外源基因 IE1终止子 载体第五十页，讲稿共九十二页哦三、外源基因在植物中表达1.Ti质粒存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。第五十一页，讲稿共九十二页

25、哦第五十二页，讲稿共九十二页哦（1）Ti质粒的结构环状双链DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）(相当于细菌染色体的3%-5%）。第五十三页，讲稿共九十二页哦 T-DNA（transfer-DNA）转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。生长素 细胞分裂素 冠瘿碱 基因 基因 合成 右边界左边界生长素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成吲哚乙酸（植物生 长激素）的酶iaaM:色氨酸-2-单加氧酶，iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶第五十四页，讲稿共九十二页哦第五十五页，讲稿共九十二页哦毒性基因（

26、vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，进入和整合。vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIR D2蛋白结合，并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助下穿过浓杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。单链的5端是右边界区域，含有25bp重复序列，参与整合。第五十六页，讲稿共九十二页哦冠瘿碱代谢基因不相容性基因章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。控制Ti质粒的不相容性。第五十七页，讲稿共九十二页哦2.农杆菌的感染和生存（1）第一步:植物受伤植物受伤后能分

27、泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。第五十八页，讲稿共九十二页哦（2）第二步：感染植物（3）第三步：毒性基因（vir）表达（4）第四步：T-DNA转移（5）第五步：诱导冠瘿瘤农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。virA、virG、virD、virBT-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。第五十九页，讲稿共九十二页哦第六十页，讲稿共九十二页哦（6）第六步：土壤农杆菌代谢冠瘿碱第六十一页，讲稿共九十二页哦3.Ti质粒的种类根据所编码的冠瘿碱（op

28、ine），分为（1）章鱼碱（octopine)型质粒第六十二页，讲稿共九十二页哦（2）胭脂碱（nopaline）型质粒（3）农杆碱（agropine）型质粒第六十三页，讲稿共九十二页哦4.Ti质粒转化的对象5.Ti质粒作为载体的可能性（1）能够自发地整合到植物的染色体上。（2）能转化多种植物。（3）强启动子：T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动 子，能启动外源基因的表达。裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）。第六十四页，讲稿共九十二页哦6.天然Ti质粒作载体的缺点（1）分子量太大（200kb）！（2）限制性酶切位点太多。（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。（4）

29、在大肠杆菌中不能复制。第六十五页，讲稿共九十二页哦7.Ti质粒的改造（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。（2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不 再成为肿瘤，能正常分化。（5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。（6）加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加 polyA的信号序列。第六十六页，讲稿共九十二页哦第六十七页，讲稿共九十二页哦8.Ti载体的类型（1）共整合载体（cointegrate vectors）最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时科学家P.Zambrisky等19

30、83年改造的pGV3850需要同源重组才能插入外源基因。pGV3850的特点：是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。第六十八页，讲稿共九十二页哦第六十九页，讲稿共九十二页哦 选择标记1）脓杆菌选择标记 宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。2）最终受体植物的选择标记卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。第七十页，讲稿共九十二页哦 外源基因插入pGV3850的过程第七十一页，讲稿共九十二页哦pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3

31、850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。第七十二页，讲稿共九十二页哦第七十三页，讲稿共九十二页哦（2）双元载体（binary vectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。双元载体的结构Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。大幅度减小质粒的体积。（10kb）Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）第七十四页，讲稿共九十二页哦第七十五页，讲稿共九十二页哦 双元载体的转化1）基因插入转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。Vir产物使双元载体上的T-DNA左右边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。2）帮助质粒

32、（helper plasmid）受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。第七十六页，讲稿共九十二页哦第七十七页，讲稿共九十二页哦四、在哺乳动物细胞中表达1.动物细胞基因克隆和表达载体SV40病毒2.人乳多空BK病毒载体第七十八页，讲稿共九十二页哦1.动物细胞基因克隆和表达载体SV40病毒常用的SV40载体，是从猿猴空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40）改造而来的。第七十九页，讲稿共九十二页哦（1）SV40病毒的结构 20面体外壳：由VP1、VP2和VP3三种病毒外壳蛋白构成。DNA：5234bp的环状双链。

33、第八十页，讲稿共九十二页哦（2）SV40感染和生存方式SV40猿猴细胞啮齿类细胞细胞裂解 细胞癌变释放SV40 SV40 DNA 整合到寄主染色体上Permissive nonpermissive受纳细胞第八十一页，讲稿共九十二页哦第八十二页，讲稿共九十二页哦第八十三页，讲稿共九十二页哦第八十四页，讲稿共九十二页哦（3）SV40复制起始位点第八十五页，讲稿共九十二页哦（4）SV40病毒的转录和翻译 早期表达区：编码大T抗原（控制DNA复制）和小t抗原。晚期表达区：在DNA复制一段时间后表达，产物是VP1、VP2和VP3 三种外壳蛋白。第八十六页，讲稿共九十二页哦（5）SV40病毒的整合（6）S

34、V40病毒的包装有严格的包装限制。如果插入的外源基因过大，就无法包装。对非受纳细胞（non permissive cells），只有T抗原表达，随后病毒基因随机整合到宿主染色体上。第八十七页，讲稿共九十二页哦(7)SV40基因组的改造 去掉一部分DNA(T抗原或者VP基因）。助手型SV40去掉T抗原基因的病毒，保留晚期复制启动子。不能复制，但能包装。提供外壳蛋白。第八十八页，讲稿共九十二页哦重组型SV40去掉VP基因，插入外源基因的病毒，保留早期表达启动子。不能包装，但能复制。提供重组DNA和T抗原。包装重组型SV40需要这两种缺陷型病毒混合感染，才能互补。既能使插入SV40的外源基因复制，又

35、能使外源基因被包装进病毒颗粒，得以扩增。第八十九页，讲稿共九十二页哦(8)SV40混合传染过程助手型SV40:提供VP外壳蛋白。重组型SV40：提供T抗原。包装成的病毒颗粒中，既有含外源基因的重组型，又有助手型DNA。第九十页，讲稿共九十二页哦(9)COS细胞用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的。所以称COS（CV-1，Origin,SV40）COS细胞的特点：有SV40的T抗原。有利于SV40来源的载体复制。病毒不能复制，但能产生T抗源（类似重组型SV40）。DNA整合到猴染色体上。所以COS细胞中只有T抗原，无游离的SV40DNA。第九十一页，讲稿共九十二页哦第九十二页，讲稿共九十二页哦