其它有机酸发酵工艺苹果酸讲稿.ppt
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1、其它有机酸发酵工艺苹果酸第一页,讲稿共四十八页哦4.2.1概述概述L-苹果酸苹果酸(L-malic acid简称简称L-Ma)是生物体是生物体糖代谢过程中产生的重要有机酸,广泛存在糖代谢过程中产生的重要有机酸,广泛存在于生物体中、在未成熟的苹果、葡萄、樱桃于生物体中、在未成熟的苹果、葡萄、樱桃等的水果和蔬菜中含量约为等的水果和蔬菜中含量约为0.4%。苹果酸发酵研究历史。苹果酸发酵研究历史。我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作。我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作。苹果酸发酵生产的现状。苹果酸发酵生产的现状。第二页,讲稿共四十八页哦苹果酸发酵研究历史早在早在20世纪世纪20代代Kostychev
2、等利用蔗糖发酵等利用蔗糖发酵时,在加时,在加CaCO3的培养基中就获得了的培养基中就获得了L-苹果苹果酸。酸。1959年阿部重雄等普查了年阿部重雄等普查了260株曲霉、株曲霉、120株株青霉和青霉和80株根霉的产苹果酸能力,选出了黄株根霉的产苹果酸能力,选出了黄曲霉曲霉A-114菌株,并对此菌株进行发酵条件菌株,并对此菌株进行发酵条件的探索。摇瓶发酵的探索。摇瓶发酵79d、产苹果酸最高浓、产苹果酸最高浓度可达度可达50g/L。第三页,讲稿共四十八页哦1976年米光英一,利用出芽短梗霉年米光英一,利用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)可直接由糖质)可直接由糖质原料生产原
3、料生产L-苹果酸。苹果酸。例如由葡萄糖例如由葡萄糖50g、NaNO3 2.0g、KH2PO4 1.5g、MgSO47H2O 0.05g、酵母膏、酵母膏0.05g,水水1.0L配成培养基、灭菌冷却后,接种出芽配成培养基、灭菌冷却后,接种出芽短梗霉,同时加短梗霉,同时加CaCO3 2%,27振荡培养振荡培养5d,1.0L培养基中含培养基中含L-苹果酸苹果酸25.2g。第四页,讲稿共四十八页哦酶催化法生产苹果酸酶催化法生产苹果酸日本田道制药公司首创以精制富马酸为原料,通过产日本田道制药公司首创以精制富马酸为原料,通过产氯杆菌菌体固定化,将富马酸转化成氯杆菌菌体固定化,将富马酸转化成L-苹果酸。苹果酸
4、。1972年,千火田一郎等,以产氨短杆菌为生产菌株,年,千火田一郎等,以产氨短杆菌为生产菌株,以聚丙烯酰胺凝胶为载体进行菌体固定化连续生产以聚丙烯酰胺凝胶为载体进行菌体固定化连续生产L-苹果酸。苹果酸。但利用此菌种进行反应过程中,副产物琥珀酸很难与但利用此菌种进行反应过程中,副产物琥珀酸很难与L-苹果酸分开苹果酸分开,经过反复试验,用含经过反复试验,用含脱氧胆酸脱氧胆酸或或胆酸胆酸的基质溶液进行处理,可抑制副产物琥珀酸的生成。提高了的基质溶液进行处理,可抑制副产物琥珀酸的生成。提高了L-苹果酸的产苹果酸的产量。在工业生产上选择了最廉价的胆汁为胆酸。抑制副产物琥珀酸的生成量。在工业生产上选择了最
5、廉价的胆汁为胆酸。抑制副产物琥珀酸的生成。1974年田边制药公司以此法进行年田边制药公司以此法进行L-苹果酸连续生产。在容苹果酸连续生产。在容积积1000L的充填塔中,日夜连续反应,日产的充填塔中,日夜连续反应,日产L-苹果酸苹果酸15.4吨吨。第五页,讲稿共四十八页哦1987年 Chikata、Ichiro等建立了一个1000L的以K-卡拉胶固定黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)的固定化反应柱,持续6个月,每小时能生产42.2Kg/L苹果酸。1990年 Fialovo、Marie等建立了一个中试车间,用藻朊酸固定棒杆菌细胞、流加富马酸盐溶液,每90d生产20吨苹果酸。田
6、道制药公司和三菱化成公司用此工艺大量生产L-苹果酸。产品主要用于医药工业的大输液、pH调节剂和某些药物的中间体。第六页,讲稿共四十八页哦我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作中国科学院北京微生物研究所研究了固定化皱褶假丝酵母中国科学院北京微生物研究所研究了固定化皱褶假丝酵母(Candida rugosa)的苹果酸生产技术。的苹果酸生产技术。福建省三明真菌研究所研究了福建省三明真菌研究所研究了L-苹果酸的霉菌固体发酵。苹果酸的霉菌固体发酵。1981年起无锡轻工大学金其荣等,普查了年起无锡轻工大学金其荣等,普查了261株各种曲霉的苹果酸生株各种曲霉的苹果酸生产能力,并对菌种进行了诱变处理和发酵最佳条
7、件的探讨,选出了产能力,并对菌种进行了诱变处理和发酵最佳条件的探讨,选出了优良菌株黄曲霉优良菌株黄曲霉(Aspergillus flavus)UVT3,并在昆山味精厂协作下,并在昆山味精厂协作下完成了完成了500L罐中试,产率稳定在罐中试,产率稳定在68%左右。左右。1991年吴梧桐用年吴梧桐用K-卡拉胶固定黄色短杆菌胶,用卡拉胶固定黄色短杆菌胶,用0.3mol/L KCl作作固化剂,胆汁酸作激活剂、半衰期为固化剂,胆汁酸作激活剂、半衰期为200d。以富马酸钠为底物,反应生成以富马酸钠为底物,反应生成L-苹果酸钠和剩余的富马酸钠。利用苹果苹果酸钠和剩余的富马酸钠。利用苹果酸钙溶解度比富马酸钙低
8、的特性,将酸钙溶解度比富马酸钙低的特性,将L-苹果酸从混合液中分离出来。苹果酸从混合液中分离出来。第七页,讲稿共四十八页哦L-苹果酸生产现状目前世界苹果酸主要生产国有美国、加拿大、日本等,世界总产量每年约为目前世界苹果酸主要生产国有美国、加拿大、日本等,世界总产量每年约为10万吨,万吨,其中其中L-苹果酸产量每年约为苹果酸产量每年约为4万吨,而世界市场潜在需求量达到每年万吨,而世界市场潜在需求量达到每年6万吨,日本是万吨,日本是世界主要的世界主要的L-苹果酸生产国与出口国苹果酸生产国与出口国主要生产厂商:日本扶桑化学公司,美国主要生产厂商:日本扶桑化学公司,美国Denka化学公司,加拿大化学公
9、司,加拿大Batek化学公化学公司以及英国、南非等,但这些公司是用化学合成法生产,产品为司以及英国、南非等,但这些公司是用化学合成法生产,产品为DL-苹果酸,苹果酸,每吨售价每吨售价2.4-3.0万元人民币。万元人民币。日本扶桑、理研、川崎化成三家公司的苹果酸生产能力占世界生产能力之日本扶桑、理研、川崎化成三家公司的苹果酸生产能力占世界生产能力之60%。由于由于D-苹果酸不能被人体所利用,因此苹果酸不能被人体所利用,因此DL-苹果酸的消费市场将受到限制。苹果酸的消费市场将受到限制。1988年苹果酸在美国酸味剂市场上占有率为年苹果酸在美国酸味剂市场上占有率为4%到到1991年上升到年上升到4.5
10、%。但由于苹。但由于苹果酸的价格太高,故只用于特殊食品。一步发酵法一旦大规模投产,的价格果酸的价格太高,故只用于特殊食品。一步发酵法一旦大规模投产,的价格将会有大幅度地下降。将会有大幅度地下降。1997年年Bayer公司称,美国和欧洲软饮料使用的酸味剂中,将减少柠檬酸用量,增加公司称,美国和欧洲软饮料使用的酸味剂中,将减少柠檬酸用量,增加L-苹苹果酸用量,尤其在使用二肽甜味剂时更能突出果酸用量,尤其在使用二肽甜味剂时更能突出L苹果酸风味,改善口感,提高产品质苹果酸风味,改善口感,提高产品质量。量。第八页,讲稿共四十八页哦目前我国的目前我国的L-苹果酸产量仅为苹果酸产量仅为1万吨左右。万吨左右。
11、主要企业有:主要企业有:常茂生物化学工程股份有限公司(产量常茂生物化学工程股份有限公司(产量3000吨),南京国海生物工程有限公司(产量吨),南京国海生物工程有限公司(产量1000吨),吨),滦南九州生物化工有限公司(产量滦南九州生物化工有限公司(产量1000吨)吨)。产量上还远落后于国外同行企业,可见市场产量上还远落后于国外同行企业,可见市场发展空间之大。发展空间之大。第九页,讲稿共四十八页哦4.2.2苹果酸的性质以及用途苹果酸的性质以及用途4.2.2.1苹果酸的性质苹果酸的性质苹果酸又名苹果酸又名羟基丁二酸羟基丁二酸或或羟基琥珀酸羟基琥珀酸性状:无色结晶,易吸潮。性状:无色结晶,易吸潮。相
12、对密度相对密度(d420)1.595。熔点约。熔点约130,沸点,沸点150(分解分解)。易溶于水,易溶于水,1g本品能溶于本品能溶于l.4mL醇、醇、1.7mL醚、醚、0.7mL甲醇甲醇、2.3mL丙醇、几乎不溶于苯。丙醇、几乎不溶于苯。具有酸味结晶体,在水中具有旋光性。具有酸味结晶体,在水中具有旋光性。分子中含有一个不对称碳原子,故有分子中含有一个不对称碳原子,故有L-、D-、DL型型3种。种。分子式:分子式:C4H6O5。HO-CH-COOH CH2-COOH第十页,讲稿共四十八页哦化学性质化学性质苹果酸用发烟硫酸处理可氧化得到75%-80%香豆酸(2-吡喃酮-5-羧酸)。苹果酸的水溶液
13、在Fe2+催化下与H2O2反应生成草酰乙酸。苹果酸在三氯化硼催化下,可与醇发生酯化反应,形成苹果酸酯。与多元醇,芳香多元羧酸作用,可形成树脂类产品,如醇酸聚树脂。苹果酸酯在氨的醇溶液中能形成苹果酸酰胺。第十一页,讲稿共四十八页哦4.2.2.2苹果酸的用途苹果酸的用途苹果酸得最大用途在食品加工业,其次在医药行业和工业苹果酸得最大用途在食品加工业,其次在医药行业和工业也有应用。也有应用。苹果酸在食品行业的应用:苹果酸在食品行业的应用:(1)苹果酸具有明显的呈味作用,其酸味柔和、爽快,与)苹果酸具有明显的呈味作用,其酸味柔和、爽快,与柠檬酸相比刺激性缓慢、保留时间长,具有特殊的香味,并柠檬酸相比刺激
14、性缓慢、保留时间长,具有特殊的香味,并且不损伤口腔和牙齿等特点。且不损伤口腔和牙齿等特点。(2)苹果酸常与人工合成的二肽甜味剂阿斯巴甜)苹果酸常与人工合成的二肽甜味剂阿斯巴甜(天冬(天冬氨酰苯丙氨酸甲酯)氨酰苯丙氨酸甲酯)配合使用,作为软饮料的风配合使用,作为软饮料的风味固定剂。味固定剂。(3)苹果酸在医学方面的作用:苹果酸在医学方面的作用:由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置,可直由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置,可直接参与人体代谢,被人体直接吸收,实现短时间内向接参与人体代谢,被人体直接吸收,实现短时间内向肌体提供能量,消除疲劳,起到抗疲劳、迅速恢复体肌体提供能量,消除疲劳,起
15、到抗疲劳、迅速恢复体力的作用。力的作用。第十二页,讲稿共四十八页哦第十三页,讲稿共四十八页哦、由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置,可直接参与人体代由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置,可直接参与人体代谢,被人体直接吸收,实现短时间内向肌体提供能量,消除疲劳,起到谢,被人体直接吸收,实现短时间内向肌体提供能量,消除疲劳,起到抗疲劳、迅速恢复体力的作用利用苹果酸的抗疲劳、护肝、肾、心脏作抗疲劳、迅速恢复体力的作用利用苹果酸的抗疲劳、护肝、肾、心脏作用可以开发保健饮料。用可以开发保健饮料。、代谢的正常运行可以使各种营养物质顺利分解,促进食物在代谢的正常运行可以使各种营养物质顺利分解,促进食
16、物在人体内吸收代谢,低热量,可有效地防止肥胖,可以起到减肥的作人体内吸收代谢,低热量,可有效地防止肥胖,可以起到减肥的作用。用。、在药物中添加苹果酸可增加其稳定性,促进药物在人体的吸在药物中添加苹果酸可增加其稳定性,促进药物在人体的吸收、扩散;复合氨基酸输液生产中就是利用收、扩散;复合氨基酸输液生产中就是利用L-苹果酸这一功能而用它苹果酸这一功能而用它来调节来调节pH值的,同时作为混合氨基酸输液组分之一,可提高氨基值的,同时作为混合氨基酸输液组分之一,可提高氨基酸利用率,用于治疗尿毒症、高血压等和减少抗癌药物对正常细胞酸利用率,用于治疗尿毒症、高血压等和减少抗癌药物对正常细胞的侵害,用于癌症放
17、、化疗后的辅助药物,用于烧伤治疗可以促进的侵害,用于癌症放、化疗后的辅助药物,用于烧伤治疗可以促进伤口愈合。伤口愈合。、L-苹果酸可以促进氨代谢,降低血氨浓度,对肝脏有保护苹果酸可以促进氨代谢,降低血氨浓度,对肝脏有保护作用,是治疗肝功能不全、肝衰竭、肝癌尤其是肝功能障碍导作用,是治疗肝功能不全、肝衰竭、肝癌尤其是肝功能障碍导致的高血氨症的良药。致的高血氨症的良药。第十四页,讲稿共四十八页哦、L-苹果酸作为治疗心脏病基础液成分之一,用于苹果酸作为治疗心脏病基础液成分之一,用于K+、Mg2+的补充,保持心肌的能量代谢,对心肌梗塞的缺血的补充,保持心肌的能量代谢,对心肌梗塞的缺血性心肌层起到保护作
18、用。性心肌层起到保护作用。、L-苹果酸是乳酸钙注射液的稳定剂,也可作为抗癌药的苹果酸是乳酸钙注射液的稳定剂,也可作为抗癌药的前体及用作动物生长促进剂。前体及用作动物生长促进剂。、抗牙垢,苹果酸具有酸度大、味道柔和、香味独特、抗牙垢,苹果酸具有酸度大、味道柔和、香味独特及苹果酸的腐蚀破坏作用比较弱,相应的牙釉质磨损体及苹果酸的腐蚀破坏作用比较弱,相应的牙釉质磨损体积损失较小,有不损害口腔和牙齿等特点。积损失较小,有不损害口腔和牙齿等特点。、可以改善脑组织的能量代谢、可以改善脑组织的能量代谢,调整脑内神经递质调整脑内神经递质,有利于有利于学习记忆功能的恢复,对学习学习记忆功能的恢复,对学习 记忆有
19、明显的改善作用记忆有明显的改善作用第十五页,讲稿共四十八页哦其他行业的应用:其他行业的应用:苹果酸具有抗氧化和较强的螯合作用,作为保色剂和增效剂,广泛苹果酸具有抗氧化和较强的螯合作用,作为保色剂和增效剂,广泛用于染料工业;用于染料工业;用由于用由于pH值调节,因此可作牙膏及烟草的调味剂、皮肤清洁剂、值调节,因此可作牙膏及烟草的调味剂、皮肤清洁剂、焊锡助焊剂、洗涤剂、废气脱硫剂、锅炉水垢清洁剂、空气清洁剂焊锡助焊剂、洗涤剂、废气脱硫剂、锅炉水垢清洁剂、空气清洁剂和除臭剂,特别是清除室内鱼腥臭、香烟臭及食品贮藏室的异味,和除臭剂,特别是清除室内鱼腥臭、香烟臭及食品贮藏室的异味,代替柠檬酸作为各种金
20、属表面或容器的除锈剂。代替柠檬酸作为各种金属表面或容器的除锈剂。苹果酸是制备特殊性能聚合物的单体,用苹果酸聚合可合成生物降苹果酸是制备特殊性能聚合物的单体,用苹果酸聚合可合成生物降解塑料,有利于环境保护;解塑料,有利于环境保护;在建材行业,苹果酸添加在水泥中,可缩短凝固时间,防止碱性聚合在建材行业,苹果酸添加在水泥中,可缩短凝固时间,防止碱性聚合反应发生,提高混凝土的强度,反应发生,提高混凝土的强度,代替草酸作为各种石块的表面清洗剂,使其表面变得光滑、平代替草酸作为各种石块的表面清洗剂,使其表面变得光滑、平整、美观;整、美观;苹果酸还可作为饲料添加剂,改善汽车排气质量或应用于海带养殖业苹果酸还
21、可作为饲料添加剂,改善汽车排气质量或应用于海带养殖业。第十六页,讲稿共四十八页哦4.2.3苹果酸的生产方法苹果酸的生产方法目前采用的和发酵或生物转化法相关的方法目前采用的和发酵或生物转化法相关的方法主要有:一步发酵法,二步发酵法,固定化主要有:一步发酵法,二步发酵法,固定化细胞或酶法转化。细胞或酶法转化。4.2.3.1一步发酵法一步发酵法(1)一步发酵法产苹果酸菌种的选育)一步发酵法产苹果酸菌种的选育(2)一步发酵法发酵工艺与条件)一步发酵法发酵工艺与条件4.2.3.2二步发酵法二步发酵法4.2.3.3固定化细胞或酶法固定化细胞或酶法第十七页,讲稿共四十八页哦4.2.3.1一步发酵法(1)一步
22、发酵法产苹果酸菌种的选育直接发酵法主要采用的微生物是:黄曲霉、直接发酵法主要采用的微生物是:黄曲霉、米曲霉米曲霉(Aspergillus oryzae)、寄生曲霉、寄生曲霉(Asp.parasiticus)、出芽短梗霉、出芽短梗霉(Aureabasidium pullulans)等。等。特点:三羧酸循环中苹果酸到草酰乙酸这一特点:三羧酸循环中苹果酸到草酰乙酸这一步的苹果酸脱氢酶缺失或处于低水平使得苹步的苹果酸脱氢酶缺失或处于低水平使得苹果酸得以积累。果酸得以积累。第十八页,讲稿共四十八页哦(2)一步发酵法发酵工艺与条件一步发酵法又称直接发酵法,即采用一种微生物直接一步发酵法又称直接发酵法,即采
23、用一种微生物直接发酵糖质原料或非糖质原料(如正构烷烃)生成发酵糖质原料或非糖质原料(如正构烷烃)生成L-苹苹果酸的方法。以糖类为原料,由黄曲霉、米曲霉等直果酸的方法。以糖类为原料,由黄曲霉、米曲霉等直接发酵生产苹果酸接发酵生产苹果酸 第十九页,讲稿共四十八页哦金其荣等选出的黄曲霉金其荣等选出的黄曲霉T2803菌种,经诱变剂联合处理后经,获得株菌种,经诱变剂联合处理后经,获得株 产酸较稳定的菌种产酸较稳定的菌种TH5007。可用薯干粉经。可用薯干粉经-淀粉酶液化后作初糖进行发酵,而在发酵中间加入葡萄糖,使总糖达到淀粉酶液化后作初糖进行发酵,而在发酵中间加入葡萄糖,使总糖达到13%,发酵产发酵产L
24、-苹果酸达苹果酸达7.33%,扣除杂酸,对糖转化率为,扣除杂酸,对糖转化率为56.4%,发酵强度,发酵强度1g(Lh)的结果。的结果。刘建军等人从土壤中分离出几株直接利用糖质原料生产刘建军等人从土壤中分离出几株直接利用糖质原料生产L-苹果酸的黄曲霉菌株,经紫外线、亚硝基苹果酸的黄曲霉菌株,经紫外线、亚硝基胍胍,Co60,硫酸二乙脂等诱变处理、高酸和高渗透压平板分离,获得一株硫酸二乙脂等诱变处理、高酸和高渗透压平板分离,获得一株L-苹果酸高产突变苹果酸高产突变株黄曲霉株黄曲霉HA5800,以,以100g/L的葡萄糖为碳源的葡萄糖为碳源,35,200r/min摇瓶发酵摇瓶发酵120h,L-苹果酸产
25、率稳苹果酸产率稳定在定在72g/L以上,糖酸转化率达以上,糖酸转化率达74.23%。传代实验证明该菌株产酸性能稳定。传代实验证明该菌株产酸性能稳定吴清平等人以曲霉菌吴清平等人以曲霉菌LMO2为出发株,选育出为出发株,选育出Nl-14、NEUl2、Nul416和和Nul419。其中其中N1-14菌种可以蔗糖、液化淀粉、甜菊糖为碳源,最大发酵体积为菌种可以蔗糖、液化淀粉、甜菊糖为碳源,最大发酵体积为20m3,发酵,发酵120h产产L苹果酸酸苹果酸酸85.8gL并己取得了中国专利并己取得了中国专利(CN1112160)。以色列以色列Battat 等人报道黄曲霉等人报道黄曲霉(ATCC13697)以葡
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