实验二蛋白质及氨基酸的显色反应.ppt
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1、关于实验二蛋白质及氨基酸的显色反应现在学习的是第1页,共27页实验二、蛋白质及氨基酸的显色反应 v目的和要求 1.学习和了解常用的几种鉴定蛋白质与氨基酸的方法。2.进一步认识氨基酸是蛋白质的基本组成单位。现在学习的是第2页,共27页、双缩脲反应(Biurea reaction)v原理:双缩脲反应:在碱性条件下,双缩脲与二价铜离子作用,生成紫红色配合物的反应。当加热至 180左右时,两分子尿素缩合脱去一分子氨,生成双缩脲。在肽和蛋白质分子中具有肽键,其结构与双缩脲类似,也能发生此反应,生成蓝紫色或紫红色的配合物。该反应常用于蛋白质的定性或定量测定。此反应所产生颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与
2、蛋白质分子量及氨基酸成分无关。现在学习的是第3页,共27页紫红色铜双缩脲复合物分子结构为:紫红色铜双缩脲复合物分子结构为:现在学习的是第4页,共27页v操作步骤 一、取少量尿素结晶,放入干燥试管中,用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时,停止加热,尿素放出氨,形成双缩脲。冷却后,加 10%NaOH溶液约1mL,振荡混匀,再加入1%CuSO 溶液1滴,振荡之。观察出现的粉红颜色。(避免添加过量硫酸铜,生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色)。二、取另一支试管,加 1mL蛋白质溶液和10%氢氧化钠溶液2mL,摇匀,再加1%硫酸铜溶液两滴,随加随摇,观察紫玫瑰色的出现。现在学习的是第5页,共27页、茚三
3、酮反应(Ninhydrin reaction)v原理:除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外,所有的-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应分两步进行,首先是氨基酸被氧化,产生 CO 、NH 3 和醛,而水合茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步是所生成之还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。现在学习的是第6页,共27页、茚三酮反应(Ninhydrin reaction)此反应的适宜pH为5-7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同,酸度过大时甚至不显色。该反应十分灵敏,1:1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能显示反应,因此是一种常用
4、的氨基酸定量方法。现在学习的是第7页,共27页v操作步骤 一、取 2支试管分别加入蛋白质溶液和0.5%甘氨酸溶液1mL,再加0.5mL 0.1%茚三酮水溶液混匀,在沸水浴中加热12min,观察颜色由粉色变成紫红色再变蓝。二、在一小片滤纸上滴上一滴 0.5%的甘氨酸溶液,风干后,再在原处滴0.1%的茚三酮乙醇溶液一滴,在微火旁烘干显色,观察紫红色斑点的出现。现在学习的是第8页,共27页、黄色反应(Xanthoproteic reaction)v原理 凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用产生黄色的硝基苯衍生物。该化合物在碱性溶液中进一步转化成深橙色的硝醌酸钠。在蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基易发生
5、上述反应,而苯丙氨酸不易硝化,需加少量浓硫酸催化才能呈明显的正反应。皮肤、指甲、头发等遇浓硝酸变黄即为这一反应的结果。现在学习的是第9页,共27页v操作步骤:一、取一支试管加 4滴0.5%苯酚溶液,再加浓硝酸2滴,观察黄色出现,冷却后逐滴加入10%氢氧化钠溶液,观察颜色转变为橙。二、取一支试管加蛋白质溶液4滴及浓硝酸2滴,由于强酸的作用,开始蛋白质形成白色沉淀,小火加热,则沉淀变为黄色,冷却之,逐滴加入10%氢氧化钠溶液,颜色由黄色转变成深橙黄色。三、剪少许指甲或头发放入试管中,加入数滴浓硝酸,观察颜色变化。现在学习的是第10页,共27页管号管号1 12 23 34 4材料材料0.50.5苯酚
6、苯酚鸡蛋清液鸡蛋清液指甲指甲头发头发量(滴量(滴)4 44 4少许少许少许少许浓硝酸(滴)浓硝酸(滴)4 42 220202020现象现象加入加入NaOHNaOH后后现象变化现象变化黄色反应现在学习的是第11页,共27页、坂口反应(Sakaguchi reaction)v原理 在次溴酸钠或次氯酸钠存在的条件下,许多含有胍基的化合物(如胍乙酸、甲胍、胍基丁胺等)能与-萘酚发生反应生成红色物质。在20种氨基酸中唯有精氨酸含有胍基,所以只有它呈正反应。现在学习的是第12页,共27页、坂口反应(Sakaguchi reaction)生成的氨被次溴酸钠或次氯酸钠氧化生成氮。该反应中过量的次溴酸钠或次氯酸
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