大规模细胞培养及发酵技术课件.ppt

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1、现在学习的是第1页，共42页 动物细胞的特点：动物细胞的特点：无细胞壁无细胞壁倍增时间长，生长缓慢倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成聚集体形成原代细胞培养原代细胞培养50代即开始退化代即开始退化现在学习的是第2页，共42页 动物细胞培养的定义：动物细胞与动物细胞培养的定义：动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术持结构和功能的一门

2、技术现在学习的是第3页，共42页 生长特性生长特性贴壁生长型：如人胚肺细胞，贴壁生长型：如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞细胞，巨噬细胞，神经细胞悬浮生长型：如血液白细胞、淋巴悬浮生长型：如血液白细胞、淋巴细胞等细胞等现在学习的是第4页，共42页 体外培养特点体外培养特点 体外培养工具体外培养工具 体外培养条件体外培养条件 体外细胞生长增殖过程体外细胞生长增殖过程 培养方法培养方法 大规模培养技术大规模培养技术现在学习的是第5页，共42页 营养条件苛刻营养条件苛刻 适应性差，敏感适应性差，敏感 培养时间长，易污染培养时间长，易污染现在学习的是第6页，共42页 温度，温度，37 pH

3、：7.2-7.4 气体：氧，二氧化碳，氮气气体：氧，二氧化碳，氮气 营养条件：需要多种氨基酸，维生素，辅营养条件：需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可由血清提供，其中多种成分可由血清提供现在学习的是第7页，共42页现在学习的是第8页，共42页 反应器贴壁培养反应器贴壁培养容易换液，不需特殊的分离细胞和培养液的设备，可采用灌容易换液，不需特殊的分离细胞和培养液的设备，可采用灌流培养获得高密度，但扩大规模较难，适合制备量小，流培养获得高密度，但扩大规模较难，适合制备量小，价值高的生物药品。（价值高的生物药品。（Celli

4、Gen PlusTM）微载体培养微载体培养最有前途的动物细胞大规模培养技术，兼有悬浮培养和贴最有前途的动物细胞大规模培养技术，兼有悬浮培养和贴壁培养的优点，易于放大。（壁培养的优点，易于放大。（Cytodex，Cytopore和和Cytoline）无血清悬浮培养无血清悬浮培养用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养技术的一种细胞培养技术现在学习的是第9页，共42页 pH 溶氧溶氧 温度温度 谷氨酸谷氨酸/谷氨酰胺谷氨酰胺 葡萄糖葡萄糖 乳酸乳酸 CO2现在学习的是第10页，共42页 NH4+K+/Na+Ca+渗透压渗透压 细胞密度细

5、胞密度现在学习的是第11页，共42页 细胞凋亡细胞凋亡 细胞在高密度条件下，由于细胞的细胞在高密度条件下，由于细胞的多层生长，存在细胞接触抑制效应多层生长，存在细胞接触抑制效应，细胞的生长和表达均受到严重影，细胞的生长和表达均受到严重影响响现在学习的是第12页，共42页 细胞凋亡主要是细胞生长的条件较恶劣，包细胞凋亡主要是细胞生长的条件较恶劣，包括：括：1.营养缺乏营养缺乏2.有害代谢产物的积累有害代谢产物的积累3.pH和溶氧控制不当和溶氧控制不当4.机械搅拌剪切力较大机械搅拌剪切力较大5.渗透压渗透压现在学习的是第13页，共42页 生产疫苗生产疫苗 蛋白质和多肽药物蛋白质和多肽药物 基因治疗

6、基因治疗 单抗单抗现在学习的是第14页，共42页概述概述传统：酿酒、抗生素、制醋传统：酿酒、抗生素、制醋基因工程：生产蛋白质药物、疫苗等基因工程：生产蛋白质药物、疫苗等（大肠杆菌、酵母）（大肠杆菌、酵母）一般采用高密度发酵技术一般采用高密度发酵技术现在学习的是第15页，共42页培养过程决定于：培养过程决定于：菌种菌种培养条件培养条件现在学习的是第16页，共42页微生物培养过程重要参数：微生物培养过程重要参数：温度温度pH溶氧溶氧葡萄糖葡萄糖/甘油甘油乙酸乙酸现在学习的是第17页，共42页 乳酸乳酸 NH4+磷酸盐磷酸盐 乙醇乙醇(酵母酵母)甲醇甲醇(酵母酵母)细胞密度细胞密度现在学习的是第18

7、页，共42页发酵培养基发酵培养基表达基因的调控表达基因的调控宿主菌宿主菌质粒的拷贝数及稳定性质粒的拷贝数及稳定性现在学习的是第19页，共42页高密度培养的关键是发酵的补料控制高密度培养的关键是发酵的补料控制,根据重组菌根据重组菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养物质的流加方式物质的流加方式恒速流加恒速流加变速流加变速流加指数流加指数流加现在学习的是第20页，共42页微生物高密度培养乙酸的形成微生物高密度培养乙酸的形成:培养液中葡萄培养液中葡萄糖的含量超过菌体生长所需量或在缺氧的糖的含量超过菌体生长所需量或在缺氧的情况下情况下,便会大量产生乙酸便会大

8、量产生乙酸.减少乙酸的策略减少乙酸的策略:限制性流加葡萄糖限制性流加葡萄糖甘油代替葡萄糖甘油代替葡萄糖降低培养温度降低培养温度现在学习的是第21页，共42页 宿主菌宿主菌 降低比生长速率降低比生长速率 透析培养透析培养现在学习的是第22页，共42页了解生物技术的应用现在学习的是第23页，共42页不同的细胞具有不同最佳不同的细胞具有不同最佳 pH范围范围pH 能影响葡萄糖和谷氨酰胺的能影响葡萄糖和谷氨酰胺的代谢，在低代谢，在低pH条件下，葡萄糖条件下，葡萄糖消耗速度慢消耗速度慢pH能影响细胞的生长和目标产物能影响细胞的生长和目标产物的量的量Effects of pH on IgGProducti

9、on0102030406.877.2 7.4 7.6pH Unitslog H+现在学习的是第24页，共42页在细胞培养过程中，在细胞培养过程中，CO2 与碳酸氢盐形成缓冲对，稳定培养液中的与碳酸氢盐形成缓冲对，稳定培养液中的 pHCO2也可用于计算呼吸商，反应细胞活力和代谢旺盛程度也可用于计算呼吸商，反应细胞活力和代谢旺盛程度细胞代谢（呼吸作用）会产生细胞代谢（呼吸作用）会产生CO2(废物废物)CO2 水平增加会抑制细胞生长和细胞活性，从而影响目标蛋白的水平增加会抑制细胞生长和细胞活性，从而影响目标蛋白的表达，当溶液中表达，当溶液中CO2达到达到14-15%时，会严重抑制细胞的生长时，会严重

10、抑制细胞的生长CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-现在学习的是第25页，共42页葡萄糖等需氧来氧化产生葡萄糖等需氧来氧化产生ATP供细胞的能量供细胞的能量 用于测量和跟踪细胞消耗氧用于测量和跟踪细胞消耗氧的速率的速率.Oxygen Consumption Rate of Cells inCulture00.10.20.31015202530354045Time(min)O2:mmol/L现在学习的是第26页，共42页 在细胞培养和发酵过程中，在细胞培养和发酵过程中，O2 通常是限制营养成分，是因为它在溶通常是限制营养成分，是因为它在溶液中低溶解度液中低溶解度:通常关心对培养液中通常关心对

11、培养液中%O O2 2,也就是也就是“溶氧溶氧”值值(DO):DO):理论理论DO:80%+/-5%(DO:80%+/-5%(哺乳动物细胞培养哺乳动物细胞培养)90%DO2(90%DO2(细菌培养）细菌培养）O O2 2 也可能通过自由基形成对细胞造成伤害也可能通过自由基形成对细胞造成伤害,在低在低pOpO2 2 水平，细胞的水平，细胞的活性通常越高活性通常越高 (O O2 2 值必须维持在最低的水平值必须维持在最低的水平)然而然而,原代细胞可能在低原代细胞可能在低 O O2 2 条件下繁殖受延迟条件下繁殖受延迟 因而，维持正确的因而，维持正确的O O2 2的平衡，对保证所有细胞正确生长都非常

12、的平衡，对保证所有细胞正确生长都非常重要重要,一般一般30-50%30-50%现在学习的是第27页，共42页葡萄糖两个主要的功能葡萄糖两个主要的功能:细胞的主要的能量物质细胞的主要的能量物质 主要的细胞碳源主要的细胞碳源葡萄糖和谷氨酰胺是相互补充的葡萄糖和谷氨酰胺是相互补充的:产生其他代谢物产生其他代谢物(例如例如:天冬氨酸天冬氨酸)提供能量提供能量在所有细胞中通过糖酵解途径转变成丙酮在所有细胞中通过糖酵解途径转变成丙酮.葡萄糖的代谢随细胞生长而增加葡萄糖的代谢随细胞生长而增加.葡萄糖通常是细胞生长的限制因素葡萄糖通常是细胞生长的限制因素Gluc&Cell Density vs Time in

13、 Batch Culture012345601530456075808590Time(min)Gluc(mmol)00.511.52Cell Count(cells/ml)现在学习的是第28页，共42页监控细胞反应器和发酵罐中的葡萄糖水平监控细胞反应器和发酵罐中的葡萄糖水平:保证细胞正常生长所需能量保证细胞正常生长所需能量.开发延长细胞培养周期的标准补料策略开发延长细胞培养周期的标准补料策略.计算葡萄糖消耗速率和决定批次培养最佳的起始浓度计算葡萄糖消耗速率和决定批次培养最佳的起始浓度.现在学习的是第29页，共42页在培养过程中，大多数乳酸来自于葡萄糖代谢在培养过程中，大多数乳酸来自于葡萄糖代谢

14、，但也有一部分来自于谷氨酰胺代谢，但也有一部分来自于谷氨酰胺代谢.基于高细胞密度和深液位，氧的消耗非常基于高细胞密度和深液位，氧的消耗非常大大.典型的范围典型的范围(组织培养组织培养):0-5):0-5 g/Lg/LO O2 2 消耗导致乳酸的形成，最终导致消耗导致乳酸的形成，最终导致pHpH的下降的下降.对恒定的对恒定的 pH:pH:抑制细胞生长的乳酸抑制细胞生长的乳酸水平在低到水平在低到 4 mM 4 mM 到高达到高达 70 70 mM(mM(取取决于细胞决于细胞).).在大多数情况下，铵对细胞生长的抑制比乳酸在大多数情况下，铵对细胞生长的抑制比乳酸更严重更严重.Gluc&Lact in

15、 Batch Culture05101520250123456Time(days)Gluc/Lact mMLactGluc现在学习的是第30页，共42页监控长时间细胞培养中乳酸的积累监控长时间细胞培养中乳酸的积累.计算乳酸产量与葡萄糖的消耗之间的代谢关系计算乳酸产量与葡萄糖的消耗之间的代谢关系考察乳酸盐对细胞表达产物的毒害影响考察乳酸盐对细胞表达产物的毒害影响现在学习的是第31页，共42页细胞培养和发酵中铵的来源细胞培养和发酵中铵的来源:主要来源主要来源:代谢谷氨酰胺代谢谷氨酰胺(谷氨酰胺降解谷氨酰胺降解)谷氨酰胺降解成铵和吡咯烷酮酸谷氨酰胺降解成铵和吡咯烷酮酸其他氨基酸的脱氨基作用其他氨基酸

16、的脱氨基作用铵的水平也取决于细胞密度和细胞代谢方式铵的水平也取决于细胞密度和细胞代谢方式.引起细胞抑制的铵离子浓度范围引起细胞抑制的铵离子浓度范围:从从:0.5 mM(L Mouse Cells)到到:40.0 mM(M.Ascites Tumor Cells)(不同的细胞株对铵有不同的耐受度不同的细胞株对铵有不同的耐受度)Cell Counts vs Ammonia Levels OverTime0501001502002503003504004505001234567Time(min)Cell Density(cells/ml)012345678Ammonia(mM)C.D.NH3现在学习

17、的是第32页，共42页pH 会受 NH3增加的影响:NH4+NH3+H+铵的增加也会改变细胞内蛋白质的运动.监控发酵罐和生物反应器中铵的水平（废物）.推算谷胺酰胺的降解水平.考察铵浓度对细胞密度和产物浓度的影响.监控引入培养基的质量.现在学习的是第33页，共42页 增加换液的速率增加换液的速率(补料补料).).维持培养液中低的谷氨酰铵浓度减少其转化和降解维持培养液中低的谷氨酰铵浓度减少其转化和降解.在低的在低的 pH pH培养减少培养减少NHNH3 3形成形成.去除培养液中的铵去除培养液中的铵:酶转化酶转化通过特殊的通过特殊的 “PTFEPTFE”膜将膜将 NHNH3 3 扩散到低扩散到低pH

18、 pH 溶液中溶液中 使用能够逐步接受高使用能够逐步接受高 NH NH3 3 浓度的细胞浓度的细胞现在学习的是第34页，共42页与葡萄糖一样与葡萄糖一样,谷氨酰胺也是细胞的主要物质谷氨酰胺也是细胞的主要物质:*碳和氮碳和氮*能量能量 谷氨酰胺通常被认为是细胞培养的主要限制营养谷氨酰胺通常被认为是细胞培养的主要限制营养谷氨酰胺是生物合成的前体物质谷氨酰胺是生物合成的前体物质:*嘌呤嘌呤*嘌呤核苷嘌呤核苷谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受体谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受体现在学习的是第35页，共42页 监控谷氨酰胺的水平监控谷氨酰胺的水平:确保细胞生长所需的能量确保细胞生长

19、所需的能量.开发长时间细胞培养标准化补料策略开发长时间细胞培养标准化补料策略.计算谷氨酰胺的消耗速率和决定批次培养最佳的其始浓度计算谷氨酰胺的消耗速率和决定批次培养最佳的其始浓度.现在学习的是第36页，共42页 需用来计算谷氨酰胺需用来计算谷氨酰胺 需确证谷氨酸需确证谷氨酸 的浓度，确保没加进谷氨酰的浓度，确保没加进谷氨酰胺结果胺结果.谷氨酰胺的降解产物谷氨酰胺的降解产物现在学习的是第37页，共42页Na-K:对合适培养基生产很重要对合适培养基生产很重要.维持溶液维持溶液/培养基合适的离子强度培养基合适的离子强度.现在学习的是第38页，共42页 渗透压是溶液浓度的一个反应渗透压是溶液浓度的一个

20、反应:测定渗透压的参考方法是使用渗透压计测定渗透压的参考方法是使用渗透压计典型细胞培养液渗透压值典型细胞培养液渗透压值:300+/-30 mOsmol/kg.300+/-30 mOsmol/kg.渗透压升高渗透压升高 50-100 mOsmol/kg 50-100 mOsmol/kg 会明显影响某些细胞的生长会明显影响某些细胞的生长.某些溶液某些溶液/化合物可作为渗透压的保护剂化合物可作为渗透压的保护剂(维持渗透压稳定和更维持渗透压稳定和更低低).).这些物质这些物质:甘氨酸，肌氨酸，脯氨酸甘氨酸，肌氨酸，脯氨酸现在学习的是第39页，共42页用于对引进的培养基进行质量控制用于对引进的培养基进行

21、质量控制关联渗透压与细胞数、细胞活性和产量的关系关联渗透压与细胞数、细胞活性和产量的关系监控连续补加营养引起渗透压的增加监控连续补加营养引起渗透压的增加现在学习的是第40页，共42页 它是指给定体积的细胞数，可以是体积浓度或百分比浓度它是指给定体积的细胞数，可以是体积浓度或百分比浓度.它不是指活细胞数量它不是指活细胞数量(但可很好显示细胞活力）但可很好显示细胞活力）细胞活力细胞活力/活性测定取决于细胞的种类、细胞生命周期及膜的结构活性测定取决于细胞的种类、细胞生命周期及膜的结构.“活性取决于你怎样定义细胞活性取决于你怎样定义细胞.”现在学习的是第41页，共42页感谢大家观看现在学习的是第42页，共42页